研究背景全球每天有550万人忍受疼痛折磨,我国有一亿以上患者受疼痛困扰。慢性疼痛并不是一个孤立的病理生理过程,还会引起衍生疾病以及药物滥用等问题。如何有效控制慢性疼痛以及疼痛相关的健康问题具有重要的临床和现实意义。但是,慢性痛对远隔器官(例如,心脏)的功能影响及其相关机制还知之甚少。此外,目前常用的镇痛药物也存在心血管系统的毒副作用并限制了临床治疗效果,例如,非甾体类抗炎药被用于治疗急性疼痛,但是同时增加了心血管病的发病率。因此,如何从分子机制入手,寻找疼痛相关心血管事件的有效防治方法是亟待解决的重要问题。本研究旨在探讨:慢性疼痛状态下,是否存在某些共病机制导致心脏固有功能异常,使心肌出现易损状态?针对该问题的研究将为慢性痛的机制研究提供更为广阔的认识,也将为兼顾心肌保护的镇痛药物研发提供新思路。我们前期研究证实,组织细胞脂质过氧化所产生的活性羰基类物质(以4-HNE为代表,4-hydroxy-2-nonenal)可攻击蛋白质侧链形成羰基结构导致蛋白质失活变性,该过程被称为羰基应激。我们发现,羰基应激可导致蛋白质交联和关键内源性因子失活并参与多种心肌损伤过程。此外,新近的研究发现,4-HNE与疼痛关系密切,一方面4-HNE可以直接作用于瞬时受体电位(transient receptor potential,TRP)通道参与痛觉形成;另一方面,在急性炎性痛的动物模型中发现疼痛部位的4-HNE含量显著升高。4-HNE可以由疼痛产生也可以反之导致疼痛加重,由于4-HNE本身具有高度扩散性,可透过脂质膜到达组织各处。因此,外周部位疼痛与心肌羰基应激可能存在联系,而4-HNE可能在此过程中发挥重要作用。线粒体乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)是体内最重要的醛类代谢途径,是内源性醛类物质解毒的关键机制。激活ALDH2可将细胞毒性的醛氧化为酸,我们前期的工作和他人研究均发现,激活ALDH2可有效抑制4-HNE导致的心肌细胞损伤,减轻细胞醛负荷(aldehydic load)抑制羰基应激,发挥心肌保护作用。随之而来的新问题是:作为重要的内源性心肌保护因子,以ALDH2为干预靶点能否改善疼痛相关的心肌抗缺血损伤能力?如果是,关键的信号机制又是什么?SIRT 1(Silent information regulator 1,沉默信息调控蛋白1)是NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶。既往研究对SIRT1在细胞增殖,凋亡,分化和衰老过程中的生物学功能进行广泛探讨。也有研究显示,激活SIRT1可以抑制心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤。反之,SIRT1缺失或不足可显著破坏心肌的抗缺血能力,导致MI/R损伤加重,出现心肌缺血易损。但是,SIRT 1如何通过去乙酰化作用实现对MI/R心肌的保护?其具体的信号机制与通路依然有待深入研究。更为重要的是,我们之前的研究证实:SIRT1是羰基应激的重要靶点,SIRT1发生羰基化修饰可显著减弱其活性。那么,SIRT1羰基化失活是否参与了慢性痛状态下心肌的功能改变?是一个值得探讨的问题。综上所述:基于前期工作基础和相关最新发现,我们提出:慢性疼痛可能诱发羰基应激;SIRT1是羰基应激的重要靶点;SIRT1羰基化失活可能导致心肌缺血易损;ALDH2通过抑制羰基应激,可能是在慢性痛状态下保护心肌的有效途径。本研究将通过离体和整体的动物学实验,结合ALDH2基因敲除小鼠(ALDH2 KO)和基因干预手段对上述系列问题进行探讨,为疼痛相关心血管事件的有效防治提供新的策略。目的1.明确慢性病理性神经痛对心肌抗缺血能力的影响。2.探讨羰基应激在慢性病理性神经痛导致心肌缺血易损中的作用。3.明确SIRT1羰基化失活在上述病理生理过程中作用,并分析相关信号机制。初步阐明慢性痛个体发生心肌缺血易损的信号机制。4.明确激活ALDH2能否通过抑制羰基应激,保护SIRT1信号,进而实现兼顾减轻疼痛和心肌保护的作用。方法1.本研究以野生型(WT)C57小鼠为研究对象。部分实验采用ALDH2 KO小鼠为C57背景来源小鼠回交6代后获得。2.采用经典的小鼠背根节慢性压迫法(chronic compression of the dorsal root ganglion,CCD)建立慢性病理性神经痛模型(CCD组),以假手术组(non-CCD组)为对照。3.采用Von Frey filament机械刺激缩足阈值法测定疼痛行为学。4.CCD术后两周,建立小鼠心肌缺血再灌注在体模型(缺血30分钟,再灌注4小时)。5.超声心动图评估心肌收缩舒张功能;TTC染色测定心肌梗死面积;定量检测心肌Caspase-3活性,综合评估MI/R损伤程度。6.采用离体小鼠心脏灌流法测定心脏收缩舒张功能。7.定量检测循环水平的4-HNE含量。8.定量检测心肌SIRT1活性。9.定量检测心肌ALDH2活性。10.提取心肌总蛋白检测心肌蛋白质羰基化修饰程度。11.采用免疫共沉淀法检测SIRT1羰基化;LKB1乙酰化和LKB1-AMPK相互作用。12.蛋白免疫印迹方法检测ALDH2,SIRT1,LKB1,AMPK和磷酸化AMPK的表达水平。13.采用皮下注射方式,在体给予ALDH2特异性激动剂Alda-1(3mg/kg BW,3/日)。14.以9型腺相关病毒(AAV9)为载体构建包含心肌特异性启动子c TNT的ALDH2过表达病毒(AAV9-c TNT-ALDH2),以GFP过表达病毒(AAV9-c TNT-GFP)为对照,通过心腔内注射配合主动脉钳夹实现心肌特异性ALDH2过表达。结果1.慢性疼痛小鼠出现心肌缺血易损在WT小鼠中,实施L3-4背根节压迫后,损伤同侧的后爪回缩机械阈值(ipsilateral hind paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)较CCD术前显著降低并持续三周以上。Von Frey filament机械刺激缩足阈值结果也同样证实慢性病理性神经痛模型构建成功。与WT小鼠相比,ALDH2 KO小鼠的PWMT值降低更为显著,Von Frey filament机械刺激缩足阈值进一步降低(P<0.05,n=5)。上述结果提示,ALDH2与疼痛关系密切,ALDH2不足可导致慢性痛个体痛觉过敏。CCD术后2周,对WT和KO小鼠建立在体心肌缺血30分钟再灌注4小时的MI/R模型。结果发现,与non-CCD WT小鼠相比,CCD慢性疼痛状态下,小鼠心肌梗死面积增加,MI/R后心肌casapse-3活性升高,左心室射血分数(EF%)和左心室短轴缩短率(FS%)显著减退,MI/R死亡率显著升高。上述结果证实,CCD慢性疼痛可导致MI/R损伤加重,出现心肌缺血易损。更为重要的是,与CCD WT小鼠相比,CCD ALDH2-KO小鼠的MI/R损伤更为严重,出现更高的死亡率(P<0.05,n=5)。这个结果表明,ALDH2不足可进一步加重慢性痛个体心肌缺血易损程度。2.慢性痛诱发心肌羰基应激在明确了慢性痛导致心肌缺血易损后,检测循环水平的4-HNE含量发现:CCD WT小鼠术后3天血浆中的4-HNE开始升高,于2周后达到峰值(~10倍)并持续到3周以上(该结果与心肌出现缺血易损时间相一致)。并且,CCD术后2周,心肌蛋白质羰基化程度显著升高(与non-CCD WT相比,P<0.05,n=5)。该结果提示,慢性痛升高机体循环水平的醛负荷,诱发心肌羰基应激。并且,心肌羰基应激程度在ALDH2 KO小鼠中进一步恶化。3.慢性痛诱发心肌SIRT1羰基化失活通过Co-IP进一步发现:CCD术后2周,CCD WT小鼠心肌中SIRT1的羰基化程度显著升高,SIRT1活性同时减退(与non-CCD WT相比,P<0.05,n=5)。同样,慢性痛导致的心肌SIRT1羰基化失活程度在ALDH2 KO小鼠中进一步恶化。4.慢性痛小鼠缺血心肌中LKB1-AMPK信号受损AMPK是重要的心肌保护性激酶,AMPK的磷酸化激活是缺血心肌重要的内源性保护机制,而LKB1是心肌AMPK上游磷酸激酶。现已明确LKB1的乙酰化程度受SIRT1调控。我们的结果显示:CCD WT小鼠心肌中LKB1乙酰化程度升高(与non-CCD WT相比,P<0.05,n=5),该结果与SIRT1羰基化失活结果相符。并且,当CCD WT小鼠遭受心肌缺血时,LKB1与AMPK的结合能力显著降低,导致AMPK不能被磷酸化激活。上述结果提示,LKB1-AMPK信号受损可能是慢性痛小鼠心肌SIRT1羰基化失活后出现缺血易损的内在信号机制。同样,缺血心肌LKB1乙酰化和LKB1-AMPK信号受损程度在ALDH2 KO小鼠中进一步恶化(与CCD WT相比,P<0.05,n=5)。5.外源性4-HNE导致痛觉过敏和心肌缺血易损我们已经发现慢性痛可导致循环水平的4-HNE升高诱发心肌羰基应激,为了明确醛负荷在疼痛和心肌缺血易损中的衔接关系,我们在小鼠前爪注射外源性的4-HNE(150 nmol/50μl per paw)以模拟上述病理生理状态。我们发现,外源性4-HNE注射可导致持续的疼痛(120 min以上),表现为PWMT显著降低和痛觉过敏(与vehicle对照相比,P<0.05,n=5)。另一方面,外源性4-HNE注射3天后,循环水平的4-HNE出现升高,7天后升高至CCD-WT小鼠2周时内源性4-HNE水平(~10倍)。在此基础上,我们发现4-HNE的确导致心肌蛋白质羰基应激,心肌SIRT1出现羰基化失活;缺血心肌磷酸化AMPK显著减退。为了明确4-HNE的直接作用,我们采用离体心脏灌流证实,高水平的4-HNE暴露导致心肌MI/R损伤显著加重(与vehicle对照相比,P<0.05,n=5)。上述结果表明,4-HNE导致的羰基应激是引发疼痛和心肌缺血易损的重要机制。6.激活ALDH2抑制慢性痛小鼠心肌缺血易损ALDH2是体内最重要的羰基转化机制,我们随即探讨激活ALDH2对慢性痛和慢性痛诱发心肌缺血易损的影响。结果发现:对CCD-WT小鼠在体给予ALDH2特异性激动剂Alda-1治疗可显著提高PWMT,改善痛觉过敏,且不依赖于阿片受体途径。并且,激活ALDH2可有效抑制慢性痛状态下的心肌羰基应激,降低SIRT1羰基化和LKB1乙酰化程度,进而改善缺血心肌LKB1-AMPK的相互作用,提高AMPK磷酸化水平。最终,激活ALDH2有效的抑制了CCD小鼠心肌MI/R损伤,显著减小梗死面积,改善MI/R心脏收缩舒张功能。显著提高CCD小鼠MI/R的生存率。上述结果表明,针对羰基应激,激活ALDH2可以兼顾镇痛和缺血心肌保护,有效解决慢性痛诱发心肌缺血易损。7.心肌特异性高表达ALDH2上述研究已经证实慢性痛导致心肌缺血易损主要由羰基应激所介导,而心肌SIRT1-LKB1-AMPK信号是其重要的损伤靶点。因此,我们进一步探讨如何在慢性痛状态下有效的保护心脏,防止心肌缺血易损。本研究以9型腺相关病毒(AAV9)为载体构建包含心肌特异性c TNT启动子的ALDH2过表达病毒(AAV9-c TNT-ALDH2),以GFP过表达病毒(AAV9-c TNT-GFP)为对照,通过心腔内注射配合主动脉钳夹实现心肌特异性ALDH2过表达。免疫组化染色和蛋白印迹实验均证实AAV9-c TNT-ALDH2可以实现心肌特异性的ALDH2高表达。在此基础上,我们发现,在慢性痛存在的情况下,心肌特异性的ALDH2高表达有效的抑制了心肌羰基应激,有效保护SIRT1-LKB1-AMPK信号途径,有效提高慢性痛个体心肌抗缺血损伤能力。结论1.慢性病理性神经痛诱发心肌缺血易损。2.羰基应激是慢性病理性神经痛诱发心肌缺血易损的重要病理生理基础,其中,SIRT1羰基化失活发挥重要作用。3.调控LKB1乙酰化和LKB1-AMPK相互作用是SIRT1发挥心肌保护的机制之一。4.激活ALDH2可兼顾实现镇痛和心肌保护。5.我们通过AAV9-c TNT介导的基因干预方式实现心肌特异性ALDH2上调,可针对性的抑制慢性痛诱发的心肌缺血易损。本研究提示了羰基应激是慢性痛与心肌功能障碍之间重要的共病机制,针对该机制的进行干预,将为疼痛患者实现器官保护以及疼痛相关心血管并发症的防治提供全新策略。