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传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis, ILT)是由疱疹病毒科传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis virus, ILTV)引起的鸡的一种呼吸道传染病。主要临床症状为咳出含有血液的渗出物并伴发高死亡率,引起流鼻涕、结膜炎、体重和产蛋下降。本病自1925年首次报道以来,现已遍布各养禽国家和地区,我国主要呈地方流行。本研究利用原核表达系统成功表达重组蛋白His-gJ,并研制了3株针对ILTV gJ蛋白的单克隆抗体。同时以ILTV王岗(WG)株免疫SPF鸡制得多抗血清,对ILTV抗原和抗血清进行一系列标定,获得了ILTV的标准抗原和标准血清,为ILTV的诊断和防治提供了有效的方法和材料。1、抗禽传染性喉气管炎病毒酣蛋白原核表达与单克隆抗体的研制根据GenBank中已发表的传染性喉气管炎病毒gJ全基因序列设计gJ编码区(445-745位氨基酸)的特异性引物,上下游引物分别引入酶切位点BamHI和Xho I,以传染性喉气管炎病毒WG株基因组为模板进行PCR扩增,扩增产物克隆并连接到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-32a-gJ并转化到BL21(DE3)。经IPTG诱导后,获得大小为55KD的重组蛋白His-gJ。并利用亲和柱对重组蛋白His-gJ进行纯化,SDS-PAGE和Western-Blot结果表明,融合蛋白His-gJ具有良好的抗原性；利用获得的ILTV重组蛋白His-gJ为抗原,建立检测ILTV抗体的ELISA方法。以ILTV WG株全病毒作为免疫原,按照常规程序免疫6-8周龄Balb/c小鼠,取脾细胞与S/P20细胞融合,利用重组蛋白His-gJ进行间接酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选阳性细胞株,最终得到3株分泌针对ILTV gJ蛋白单克隆抗体的阳性细胞株,分别命名为：ILTV-gJ-4C6、ILTV-gJ-5B8、ILTV-gJ-6B6。Western-Blot与间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明,所得三株单抗均能与ILTV WG株天然病毒发生特异性反应。3株单克隆抗体的抗体亚类均为IgG1,Kappa链。利用亲和层系技术分别纯化了3株单抗腹水,获得了高纯度的单克隆抗体,为今后建立ILTV检测技术提供了良好的试剂材料。2、禽传染性喉气管炎病毒标准抗原及血清的制备本研究用SPF鸡胚扩增禽传染性喉气管炎病毒WG株,对收集的传染性喉气管炎病毒进行了病毒含量测定分析,结果该材料中病毒为10-49ELD50/0.2mL。血凝试验(HA)、聚合酶链式反应(PCR)及ELISA实验技术进一步鉴定了该病毒无传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、小鹅瘟病毒(GPV)、马立克氏病病毒(MDV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡产蛋下降综合症(EDS-76)、禽白血病病毒(ALV)等外源性病毒污染,无菌检验也证明该病毒材料无菌生长、无支原体污染。将该ILTV全病毒抗原经一系列标定,加入1%BSA冻存保护剂,分装,冻干,并进行物理性状和无菌检验及支原体污染检验,最后获得了ILTV的标准抗原。将ILTV WG株多次免疫SPF鸡,制得了抗ILTV多抗血清,用重组融合蛋白酣进行间接ELISA检测,结果表明该血清的ELISA效价为1：1200。利用HI、IFA实验技术鉴定该多抗血清抗体,证明该血清与上述其他病毒多抗血清无交叉反应性,仅与ILTV反应,特异性良好；无菌检验、支原体检验合格。经一系列标定后,在血清中加入万分之一的硫柳汞防腐剂,分装,冻干,并进行物理性状的检查以及均一性、稳定性、长期保存性的鉴定,最终获得了高质量的标准血清。通过标定阳性及弱阳性血清,对目前市场上常用的商品化检测ILTV抗体的ELISA试剂盒可靠性进行了测定,证明所试两种商品化ELISA试剂盒可用于临床样品检测。