论文部分内容阅读
S—腺苷甲硫氨酸(S—adenosyl-L—methionine,SAM)作为所有生物体内的重要中间代谢物,具有良好的临床应用价值。
本文通过毕赤酵母表达外源SAM合成酶基因强化SAM合成酶的胞内表达,利用酵母自身的胞内ATP和外源添加L—甲硫氨酸(L—Met),来强化SAM的合成,并分别从提高胞内SAM合成酶的酶活、优化外源添加L—Met策略和碳源补料对胞内ATP水平影响等三个方面进行了系统研究,从而实现了采用重组毕赤酵母高效生产SAM的目标。
采用毕赤酵母GS115分别表达了来源于Streptomyces spectabilis,E.coli DH5α和Saccharomyces cerevisiae的SPM合成酶基因。在摇瓶中,这三种重组毕赤酵母菌株胞内的SAM合成酶的酶活分别达到75,105和154U/g DCW:而胞内的SAM累积量分别为0.46,0.56和0.81g/L,从中可以看出胞内的SAM合成酶的酶活是SAM合成的限制性因素。为了提高外源SAM合成酶在重组毕赤酵母胞内的活力,以来源于Saccharomyces cerevisiae,E.coli DH5α和Streptomyces spectabilis的SAM合成酶基因为出发材料,利用DNAShuffling技术对SAM合成酶进行体外进化。经过筛选获得了一株整合了编码高酶活SAM合成酶基因的重组毕赤酵母菌株GS115/DS56,在摇瓶中,GS115/DS56的胞内SAM累积量为1.64g/L,SAM合成酶的酶活达到463U/g DCW,比含来源于Saccharomyces cerevisiae的SAM合成酶的重组菌GS115/pPIC3.5K—samSA分别提高了102%和201%,有效改善了胞内SAM合成酶的酶活对SAM合成的限制。
对通过DNA Shuffling技术得到的胞内SAM合成酶的酶活提高(GS115/DS16,GS115/DS56)和降低(GS115/DS4,GS115/DS34和GS115/DS69)的重组毕赤酵母菌株以及GS115/pPIC3.5K—samSA进行了G418耐受性实验,发现上述整合了外源SAM合成酶基因的重组毕赤酵母染色体中所整合的外源基因拷贝数均为1,它们胞内SAM合成酶的酶活差异是由于所表达的SAM合成酶本身的构型差异所引起的。通过对GS115/DS4,GS115/DS16,GS115/DS34,GS115/DS56和GS115/DS69所表达的重组外源SAM合成酶pDS4,pDS16,pDS34,pDS56和pDS69的结构分析得出pDS56的第18位保守氨基酸残基由K突变为R很可能是造该酶酶活提高的主要原因;pDS4和pDS69酶活下降的原因很可能分别是第281位(S突变为F)和第278位保守氨基酸残基(K突变为G)的突变;pDS34则由于翻译不完全而丧失了SAM合成酶的酶活,但是另一种高酶活的SAM合成酶pDS16酶活升高的原因还需要进一步探讨。从所分析的重组SAM合成酶的结构与酶活之间的关系中可以推测出SAM合成酶活性中心位点附近的氨基酸残基的极性增大有利于提高SAM合成酶的酶活。
需要外源添加L—Met是GS115/DS56与常规的毕赤酵母发酵的一个不同点。在5L发酵罐上的连续培养和30L发酵罐上的补料分批培养中的代谢流分布计算结果证实了L—Met流加速率的升高会降低GS115/DS56中EMP途径和TCA循环的通量,而SAM降解途径和PP途径的通量上升;同时对代谢过程中的关键酶的酶活测定发现随着L—Met流加速率的增加,柠檬酸合成酶,α-酮戊二酸脱氢酶以及丙酮酸脱氢酶的酶活下降,6-磷酸葡萄糖脱氢酶的酶活上升。从代谢流分布和关键酶的酶活测定结果可以看出,代谢流和关键酶的酶活随着L—Met流加速率的升高而发生的相关变化,抑制了GS115/DS56胞内的TCA循环和EMP途径,造成GS115/DS56的ATP合成明显不足,限制了菌体生长和SAM的合成,同时还造成了胞内的丙酮酸,琥珀酸,草酰乙酸发生累积以及α-酮戊二酸和柠檬酸浓度的下降。
L—Met添加量的增加同时还降低了GS115/DS56胞内合成苏氨酸和赖氨酸的关键酶—天冬氨酸激酶的酶活,导致苏氨酸和赖氨酸浓度的降低。苏氨酸浓度的降低还使GS115/DS56胞内总蛋白浓度降低,在发酵过程中同时添加L—Met和苏氨酸可以避免该现象并且改善菌体的生长。过量添加L—Met还使得GS115/DS56胞内半胱氨酸,精氨酸,脯氨酸和丙氨酸的浓度上升。其中半胱氨酸浓度的增加是由于L—Met添加量的上升导致SAM降解加快所造成的;精氨酸和脯氨酸的累积是由于前体物质α-酮戊二酸转化为琥珀酰CoA的反应受到抑制(α-酮戊二酸脱氢酶的酶活下降)所致;丙氨酸浓度则由于前体物质丙酮酸浓度的增加而产生了累积。
针对L—Met的过量添加对GS115/DS56累积SAM的负面效应,在5L发酵罐上采用了以0.2g/L/h的速率连续流加L—Met代替原来的分三次添加L—Met的添加策略,成功缓减了L—Met对GS115/DS56发酵过程中的菌体生长和ATP合成的抑制作用,增强了SAM累积量。该策略被成功地应用到30L发酵罐上,SAM的累积量可以达到8.37g/L。
胞内ATP浓度同样是影响SAM累积量的重要因素,本文在摇瓶发酵中采用了山梨醇—甲醇混合补料(质量比1:4),将GS115/DS56胞内ATP浓度提高了7.0%,进而SAM累积量也提高了12.0%。5L发酵罐上将甘油流加时间从20h缩短到5h和采用甘油—甲醇混合补料(质量比1:4)分别将GS115/DS56胞内ATP的平均浓度分别提高了32.8%和9.5%,使得SAM累积量也分别提高了23.4%和13.5%。同时发现流加磷酸盐可以提高胞内ATP的浓度,加快SAM的合成速率,将发酵时间缩短了24%,改善了由于连续流加L—Met导致的发酵时间延长问题而且对SAM的最高累积量没有影响。
在保证足够的胞内SAM合成酶的酶活的情况下,通过在5L发酵罐上对GS115/DS56的胞内ATP浓度和L—Met添加方式的优化,最终5L发酵罐上GS115/DS56的胞内SAM累积量从4.96g/L提高到了9.59g/L,L—Met的转化率从8.6%提高到了75.5%,SAM发酵指数也从0.049g/L/h提高到了0.10g/L/h。