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肺纤维化(Pulmonary Fibrosis,PF)是以肺实质破坏、纤维斑痕和成纤维细胞灶形成、细胞外基质过度沉积为特征的纤维增殖性疾病。多种间质性肺疾病(Interstitial Lung Disease,ILD)在晚期均可发展为弥漫性肺纤维化,其中特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)最常见。IPF的病因和发病机制尚不清楚,缺乏有效治疗手段。最近的证据表明,重要的晚期炎症因子高迁移率族蛋白B1 (High Mobility Group Box 1 protein, HMGB1),能在细胞核内作为α平滑肌动蛋白(Alpha-Smooth Muscle Action, α-SMA)基因的转录活化因子[1]诱导上皮细胞发生间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition, EMT),成为肺纤维化成纤维细胞灶中肌成纤维细胞的重要来源。在细胞外能启动丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinases, MAPKs)、核因子κB (Nuclear Factor kappa B, NF-κB)等多条信号通路,激活免疫炎症和异常修型[2]。根据IPF的临床特征和病机变化特点,在祖国医学中归属于“肺痿”、“肺痹”等疾病范畴,病位在肺、肾,属本虚标实之证。病因为外邪侵袭、久病伤肺、素体气虚等,产生痰浊、瘀血、热毒等病理产物,引起肺肾亏虚、气虚血瘀、痹阻肺络等病机改变,治疗应以益气活血通络、祛痰滋阴温阳为重点。目的：本研究以HMGB1为靶点,以人肺成纤维细胞(HFL1)、人非小细胞肺癌细胞(A549)和博莱霉素致纤维化大鼠为受试对象,从气虚血瘀的核心病机入手,结合血清药理学,采用益气活血通络的“补阳还五汤”在体内外共同干预的方法,探讨补阳还五汤治疗肺纤维化的分子机制。方法：1.不同浓度补阳还五汤含药血清对HMGB1刺激HFL1、A549后,细胞中α-SMA、细胞外调节蛋白激酶1/2 (Extracellular Regulated Protein Kinasel/2, ERK1/2)、 NF-κBp65等蛋白表达的干预作用首先采用MTT法和ELISA法检测0、10、50、100、500ng/ml的HMGB1对HFL1、A549细胞增殖和IL-6的影响。根据结果选择最佳浓度的HMGB1作为诱导剂量刺激HFL1、A549细胞,使用5%、10%、15%、20%不同浓度的补阳还五汤含药血清进行干预,作用24h后提取细胞蛋白,通过Western blot方法检测补阳还五汤含药血清在体外对α-SMA、ERK1/2、NF-icBp65等蛋白表达的影响。通过ELISA法检测细胞培养上清中IL-6、IL-1β等细胞因子的变化。2.最佳浓度补阳还五汤含药血清对HMBG1刺激]HFL1、A549后不同时间点α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2、信号传导及转录活化因子3 (Signal Transducers and Activators of Transcription 3, STAT3)、p-STAT3等蛋白的影响根据实验一选择最佳浓度的含药血清,预刺激HFL1、A549细胞0.5h后加入]3MGB1共同刺激,于0、6、24、72h提取细胞总蛋白,Western blot法检测补阳还五汤含药血清在不同时间对α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3等蛋白表达的影响。3.补阳还五汤对肺纤维化大鼠肺内HMGB1及晚期糖基化终产物受体(Receptor of Advanced Glycation End-product,RAGE)的干预作用采用博莱霉素气管滴注法复制肺纤维化模型,在7天、14天、28天分三批采集肺组织。取左肺固定于4%多聚甲醛中,通过HE染色、Masson染色检测模型复制结果。右肺匀浆,分别提取RNA和蛋白,通过PCR法检测补阳还五汤在动物体内对HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表达的影响、Western blot法检测HMGB1、α-SMA蛋白的表达情况。结果：1.MTT及ELISA结果显示,100ng/ml的HMGB1对细胞增殖和IL-6分泌的促进作用最明显,与空白对照组比较P<0.01。使用不同浓度的补阳还五汤含药血清干预HFL1、A549细胞0.5h,加入100ng/ml的HMGB1作为诱导剂共同刺激24h后,细胞内蛋白表达结果显示HMGB1可刺激HFL1、A549细胞中α-SMA表达增加,与空白对照组比较P<0.01。补阳还五汤含药血清可降低两种细胞内α-SMA的表达,其中20%含药血清组与HMGB1刺激组比较P<0.01。HMGB1、100ng/ml)刺激24h后HFL1、A549细胞内ERK1/2表达增加,在HFL1中上升趋势更明显。补阳还五汤含药血清可降低HFL1、A549细胞内ERK1/2的表达,20%含药血清组与HMGB1刺激组比较P<0.01。HMGB1 (100ng/ml)刺激24h后HFL1、A549细胞浆和细胞核中NF-κBp65的表达增加,其中HFL1细胞核中NF-κBp65的表达量高于胞浆,A549细胞浆中NF-κBp65的表达量高于胞核。补阳还五汤含药血清可降低两种细胞胞核中NF-κBp65的表达,在HFL1细胞中,20%含药血清与HMGB1刺激组比较P<0.05,在A549细胞中15%含药血清组与HMGB1刺激组比较P<0.01。HMGB1 (100ng/ml)刺激24h后HFL1、A549培养上清中IL-6和IL-1β表达增加,使用补阳还五汤含药血清干预后可降低IL-1p的表达,增加IL-6的表达,以20%含药血清组效果最佳,与HMGB1刺激组比较结果具有显著性差异。2.采用HMGB1(100ng/ml)刺激后A549细胞中α-SMA、ERK1/2、STAT3、p-STAT3表达升高,与空白对照组比较P<0.01,p-ERK1/2增高不明显。α-SMA从0小时持续升高至24小时,ERK1/2在72h达高峰。使用20%补阳还五汤含药血清干预后,可明显抑制α-SMA、ERK1/2、STAT3、p-STAT3的表达,促进p-ERK1/2的表达,差异具有统计学意义。使用HMGB1(100ng/ml)刺激HFL1后,细胞中α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2、 STAT3、p-STAT3表达均升高,与空白对照组比较P<0.01。α-SMA、 ERK1/2在72小时升高最明显,p-ERK1/2从0h持续增高到72h。使用20%补阳还五汤含药血清干预后,可降低α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3的表达,差异具有统计学意义。3.采用博莱霉素气管滴注后,模型组大鼠肺脏出现典型纤维化改变,HE和Masson结果显示在7天至28天的时间中,肺泡炎呈逐渐减轻趋势,纤维化呈逐渐增加趋势,结合Szapiel分级评分标准判断肺纤维化动物模型复制成功。肺纤维化模型组大鼠肺组织中HMGB1 mRNA, RAGE mRNA及HMGB1、α-SMA蛋白表达均增加。HMGB1 mRNA及HMGB1、α-SMA蛋白呈逐渐递增趋势,在第28天达高峰,结果具有统计学差异。RAGE mRNA呈逐渐下降趋势,在第7天达高峰后持续下降,但各时间点与空白组比较均有显著性差异,P<0.01。使用不同剂量的补阳还五汤干预后,可不同程度降低HMGB1 mRNA、RAGE mRNA及HMGB1、α-SMA蛋白表达,以补阳还五汤高剂量组效果最佳,与模型组比较P<0.01。结论：补阳还五汤可有效抑制纤维化大鼠肺组织中HMGB1、RAGE和α-SMA的表达并可在体外阻断HMGB1所激活的多个与炎症和纤维化相关的信号通路,减轻免疫损伤,抑制上皮细胞和成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,对肺纤维化产生多靶点的调控作用。