前言缺血性心脏病是人类健康主要杀手之一。据统计,美国20岁以上成年缺血性心脏病总患病率为7.0%,是死亡最常见原因之一[1,2]。在我国,随着经济增长和生活水平的提高,缺血性心脏病的患病率和死亡率逐年上升。尽管药物治疗、介入治疗、外科手术治疗取得了很大进步,但约20%患者不能进行这类治疗或者治疗效果不佳[3]。临床研究已证实良好的侧枝循环可以保护缺血心肌,提高缺血性心脏病病人的生存率[4,5]。如何促进侧枝循环的建立已成为目前防治缺血性心脏病的一大热点。严重缺血性心脏病患者中,血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)、缺氧诱导因子-1α (Hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)已被证实能促进侧枝循环的形成[6,7]。乙醛脱氢酶2(Aldehyde dehydrogenase, ALDH2)位于线粒体,是一种主要的醛类氧化酶。ALDH2基因存在一些常见突变,东亚人群中Glu504Lys突变具有很高的出现频率,在中国汉族人群中携带者约为34%,日本人群中约占46%。携带该突变将引起个体酶活性降低,杂合子仅为野生型个体ALDH2活性的十六分之一,突变纯合子体内几乎没有该酶活性[8,9]。早期主要认为ALDH2主要是酒精代谢中的关键酶,催化具有毒性的乙醛代谢为无毒性的乙酸的反应,乙酸在体内可以继续参与供能反应。2008年Science报道,ALDH2通过激活蛋白激酶Cε (Protein kinase Cε,PKCε)途径,在缺血再灌注损伤模型中发挥显著保护作用[10]。近年来,ALDH2逐渐被被证实为一种重要的内源性心脏保护因子,在心梗后心衰、心脏缺血再灌注损伤、酒精性心肌病等方面发挥重要保护作用[11]。本实验室前期研究发现：ALDH2可以对心梗后慢性缺血心肌发挥保护作用,这是通过减少脂质过氧化产物毒性醛类物质如4-羟基壬烯醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE)的产生,从而抑制JNK/p53途径来实现。2007年Nature有文章表明[12],主动脉缩窄引起的心脏压力负荷模型中,心肌细胞肥大而与之匹配的血管新生不足,导致心肌细胞相对缺血,p53通过下调HIF-1α抑制血管新生,加重心肌缺血使心功能进一步恶化；反之,抑制p53能通过促进心肌细胞周围血管新生,有效改善心肌供血,从而提高小鼠心脏射血分数。因此,ALDH2是否参与调控血管新生?同时,ALDH2参与线粒体活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生[13],而ROS亦可以调控HIF-1/VEGF途径[14]。因此本研究将从血管新生的角度研究,ALDH2作为一种内源性缺血保护因子,是否通过HIF-1/VEGF途径在慢性缺血过程中调控血管新生,从而改善组织血供代偿,促进缺血组织功能。冠状动脉慢性闭塞病变(Coronary total occlusion, CTO)由于病变的严重程度和复杂程度,具有难治性,被认为是冠脉介入治疗领域“最后的前沿”,侧枝循环的形成对CTO患者维持基础心功能至关重要[15]。考虑到ALDH2在亚洲人中具有接近半数的突变携带率,因此ALDH2基因型对CTO患者的侧枝循环形成能力的作用,对于临床工作中CTO病变高危人群的预防、治疗策略的选择和预后判断都将具有重要意义。本研究将通过收集CTO患者,来研究ALDH2基因分型和与其冠脉侧枝循环Rentrop分级的关系及其临床影响因素,从而说明ALDH2在临床缺血性心肌病中的作用。综上所述,本研究旨在研究ALDH2对慢性缺血组织血管新生的作用,并进一步阐明其分子作用机制,并通过对ALDH2基因型与CTO患者冠状动脉侧枝循环关系的临床研究来验证ALDH2对血管新生的作用和在人群中特别是东亚人群中的影响。本研究有望从血管新生角度探讨出ALDH2对慢性缺血心肌发挥保护的作用机制,阐明ALDH2基因型差异对CTO患者临床表型及预后的影响,并有望为此类患者的个体化治疗原则提供参考依据,如对ALDH2缺失型患者采取更积极的血运重建。全文共分为以下三部分：第一部分ALDH2调控慢性缺血组织的血管新生能力背景血管新生对于缺血性心脏病的发展和预后至关重要,乙醛脱氢酶2(Aldehyde dehydrogenase, ALDH2)的心肌保护作用近年来备受关注,本研究旨在探索ALDH2对慢性缺血组织血管新生的调节作用。方法动物实验,采用8周雄性ALDH2基因敲除小鼠(ALDH2-KO)和野生型C57BL/6小鼠(WT)制作下肢缺血模型,于术后1天、7天和21天用激光多普勒仪测量下肢血流灌注水平。细胞水平实验,培养大鼠心肌微血管内皮细胞(Microvascular endothelial cells, MECs),通过转染ALDH2-siRNA建立ALDH2低表达细胞；分别设立正常氧分压组和缺氧发生剂模拟缺氧6小时组,通过Metrigel胶培养观察各组微血管内皮细胞的成管能力。结果动物实验,激光多普勒检测以小鼠健测为对照统计患侧/健侧血流灌注比,发现ALDH2-KO小鼠下肢血流恢复水平比野生型小鼠更差,21天时具有显著统计学差异(p<0.05)。ALDH2-KO小鼠腓肠肌萎缩更加显著,并且免疫组化显示ALDH2-KO小鼠缺血区域的小动脉新生少。细胞水平实验,观察到对大鼠心肌MECs给予ALDH2-siRNA干扰后,在正常氧分压组及缺氧6小时组,与对照组相比ALDH2低表达细胞Metrigel胶成管能力显著减弱。结论上述结果说明,ALDH2缺陷能够抑制慢性缺血组织的血管新生,阻碍自身血运重建和功能重建。从血管新生的角度解释了ALDH2对慢性缺血心肌的保护作用,为临床缺血性疾病治疗提供新的药物作用靶点。第二部分ALDH2通过上调HIF-1α/VEGF途径促进血管新生背景近年来,ALDH2逐渐被被证实为一种重要的内源性心脏保护因子,在心梗后心衰、心脏缺血再灌注损伤、酒精性心肌病等方面发挥非常关键的保护作用。第一部分研究发现ALDH2缺陷能够显著减弱慢性缺血组织的血管新生,本研究旨在阐明其内在分子机制。方法动物实验,分组及造模同第一部分,分别取术后1天、7天和21天小鼠双侧股四头肌提蛋白。细胞实验,培养人脐静脉内皮细胞细胞系(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)进行信号通路的研究,通过转染病毒建立ALDH2低表达及高表达细胞模型,设立正常氧分压组和缺氧6小时组。分别对上述小鼠股四头肌组织和细胞,采用Western Blot方法检测ALDH2、缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)等蛋白表达水平。结果动物实验,Western Blot检测发现,ALDH2-KO小鼠缺血侧股四头肌组织在缺血后1周时与野生型小鼠相比,HIF-1α和VEGF蛋白水平显著降低(p<0.05)。培养HUVECs细胞进行Western Blot检测发现,上调ALDH2的表达,HIF-1α、VEGF蛋白水平增加；而转染质粒抑制ALDH2表达,则HIF-1α、VEGF蛋白水平显著降低。结论上述结果说明,ALDH2能够通过调节HIF-1α/VEGF通路,对慢性缺血组织的血管新生发挥调节作用,从而通过改善缺血组织血供促进功能重建。本研究解释了ALDH2调控血管新生的内在分子机制。第三部分ALDH2基因型对CTO患者冠状动脉侧枝循环分级的临床研究背景冠状动脉慢性闭塞病变(Coronary total occlusion, CTO)被认为是冠脉介入治疗领域“最后的前沿”,冠状动脉侧枝循环(Coronary collateral vessels, CCVs)的形成对CTO患者维持基础心功能至关重要。ALDH2Glu504Lys突变在亚洲人群中具有接近半数的突变携带率。本研究旨在从临床的角度,阐明ALDH2基因型对慢性缺血心肌血管新生作用。方法通过中山医院伦理审查和获得患者同意后,从在上海中山医院进行冠状动脉造影的患者中,选择收集冠状动脉慢性闭塞病变(Chronic total occlusion, CTO)患者；入选条件：左主干、左前降支、回旋支和／或右冠状动脉至少一支完全闭塞,病程大于等于3个月；排除条件：急性心肌梗塞(acute myocardial infarction, AMI),经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention, PCI)术后,冠状动脉旁路移植术(Coronary artery bypass grafting, CABG)术后,或合并先心、瓣膜病和外周血管疾病等。根据患者冠脉造影图像进行侧枝循环Rentrop分级(0级和1级合并为侧枝循环不良组,2级和3级合并为侧枝循环良好组),对ALDH2基因测序分型,收集患者临床资料,采用SPSS16.0软件进行统计分析。结果根据入选和排除条件共有153名CTO患者纳入研究,发现在ALDH2野生型中(n=83)侧枝循不良者占38.5%；突变杂合型携带患者中(n=63)侧枝不良者占44.4%；而在突变纯合型携带患者中(n=7)侧枝不良者(n=5)占71.4%,与野生型和杂合型相比侧枝循环更差(p<0.05)。结论上述结果从临床水平亦证明ALDH2活性对血管新生十分重要。并且临床中在慢性缺血性心脏病病患者中,ALDH2缺陷的个体显示出了更差的心脏侧枝循环形成能力,Glu504Lys突变纯合型个体(占亚洲人口的6-10%)。本研究为临床对携带ALDH2突变的CTO患者采取更加积极的血运重建治疗策略提供理论依据。