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小型猪被认为是异种器官移植的首选供体，然而整合在所有猪基因组中的猪内源性反转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）却因为可以在感染包括人在内的多种哺乳动物细胞，而造成了猪→人异种器官移植的恐慌。近年来，随着免疫排斥反应研究的长足发展，PERV也逐渐成为阻碍异种器官移植临床应用的重要因素。
广西巴马小型猪（BM）是目前广泛应用于医学各领域的优秀实验用小型猪，也是有望成为异种器官移植最佳供体的猪种。目前尚无广西巴马小型猪来源PERV（PERV-BM）在人源细胞基因组中整合位置、整合特点以及整合影响的报道。因此，本研究以PERV-BM切入点，研究广西巴马小型猪内源性反转录病毒整合分布和倾向以及其对宿主细胞的影响，为加快开发巴马小型猪提供技术支持，主要内容如下：
（1）PERV-BM全基因克隆与序列分析
本研究通过改进方法，分三段扩增，获得两株PERV-BM全基因序列，即PERV-BM2和PERV-BM4；病毒全长分别8860bp和8850bp，均为PERV-A亚型，有完整的LTR和gag、pol、env结构基因。序列分析发现，PERV-BM与国内小型猪同源关系较近，为96.4%~97.3%。进一步分析发现，PERV-BM2和PERV-BM4的5’LTR中均存在2.5个39bp重复序列，二者均在病毒包装信号（ψ）的重要位点发生突变，另外，PERV-BM4在env基因的表面蛋白（SU）中存在无义突变和12bp基因片段缺失，可能导致多肽链合成提前终止，从而影响SU蛋白的活性和功能。基于病毒上述分子生物学特征，推测PERV-BM在感染性、病毒包装及转录水平均低于PERV-PK，尤其PERV-BM4。
（2）HEK293-PERV-BM细胞感染模型的构建
为了研究PERV-BM对人源细胞的感染、整合以及整合的影响，本研究构建PERV-BM感染人源细胞的HEK293-PERV-BM细胞感染模型。先后采集15头广西巴马小型猪前腔静脉血，分离PBMC，并分别在植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）和聚凝胺（polybrene）的刺激下，与HEK293细胞共培养，通过巢式PCR、RT-PCR和电镜观察，显示PERV-BM2成功感染HEK293细胞，建立了HEK293-PERV-BM细胞感染模型，而其他猪只来源PERV-BM均不能感染HEK293细胞；同时，用同样的方法建立HEK293-PERV-PK细胞感染模型。RT-PCR检测发现PERV-BM的转录水平低于PERV-PK。而且随着传代，PERV-BM发生变异，朝向PERV-PK和PERV-WZS方向发展，这可能是病毒为适应细胞做出的改变。
（3）PERV-BM在人类基因组中的整合及其特征分析
通过优化的LM-PCR和TAIL-PCR，分别从3875个和1483个克隆中鉴定出4个PERV-BM和157个PERV-PK整合位点。分析各自的整合特性，发现PERV-BM倾向通过截短或插入，造成leader基因直接与人类基因组相连，其整合位点远离基因的转录起始位点和CpG岛。PERV-PK更倾向于直接整合，少数为PERV-PK通过3’LTR的U5区与人类基因组相连，而且与其他γ反转录病毒类似，PERV-PK更倾向于整合到所整合基因的转录起始位点和CpG岛附近，检出率分别为35.03%和40.13%。经鉴定，二者有一个共同的整合位点，即3号染色体上ROBO2基因的3号内含子中。
（4）PERV-BM的整合对HERV-W表达的影响
本研究建立了HERV-W gag、pol、env和syncytin-1的qPCR检测方法，用于不同代次HEK293-PERV-BM中HERV-W各基因相对表达量的检测。
检测发现，PERV-BM整合会影响HERV-W gag、pol、env和syncytin-1mRNA水平，而且不同传代次数中各基因mRNA存在差异。其中P10左右，gag、pol、env和syncytin-1相对表达量开始升高，至P30代最高，达3.72%~37.27%，之后下降；Western Blot检测显示，各代次HEK293-PERV-BM细胞感染模型中syncytin-1蛋白表达量的改变与mRNA改变趋势一致，但变化程度较mRNA小。
此外，在对第1~55代HEK293-PERV-BM细胞感染模型中HERV-W gag、pol和env基因序列分析中发现，各代次HERV-W的gag基因无变异，pol基因和env基因均表现个别位点的点突变，未检出规律性变异以及基因片段的缺失、插入。
（5）PERV-BM的整合对细胞周期、细胞凋亡及相关基因表达的影响检测发现，PERV-BM的整合会造成HEK293细胞的细胞周期和细胞凋亡发生改变，而且这些改变与细胞感染模型的代次有关。为研究其机制，分别建立检测cylin D1、CDK4、c-myc、p53、p16和k-Ras的qPCR检测方法，检测不同代次HEK293-PERV-BM细胞感染模型中各基因mRNA相对表达量，并通过Western blot检测cylin D1、CDK4、c-myc等mRNA相对表达量变化较大基因的蛋白表达量的改变。
检测发现，P10代细胞感染模型的细胞周期被阻滞在S期和G2/M期，细胞凋亡受到抑制，根据相关基因的表达，推测可能通过Rb调控通路诱导低代次细胞模型细胞周期的改变；高代次的细胞周期主要被阻滞在S期、细胞凋亡增加，根据相关基因mRNA和蛋白表达水平的改变，推测高代次细胞周期的改变可能由Rb调控通路与p53调控通路协同诱导发生。
上述结果提示PERV的感染可能存在潜在的危险。
本研究分别从病毒基因结构和特征、感染、转录、整合以及整合后对HERV-W、细胞周期、细胞凋亡的影响等方面，对PERV-BM与宿主细胞相互作用机制进行系统研究，以期为系统地建立病毒安全评价体系，加快开发巴马小型猪，实现小型猪的产业化发展。
广西巴马小型猪（BM）是目前广泛应用于医学各领域的优秀实验用小型猪，也是有望成为异种器官移植最佳供体的猪种。目前尚无广西巴马小型猪来源PERV（PERV-BM）在人源细胞基因组中整合位置、整合特点以及整合影响的报道。因此，本研究以PERV-BM切入点，研究广西巴马小型猪内源性反转录病毒整合分布和倾向以及其对宿主细胞的影响，为加快开发巴马小型猪提供技术支持，主要内容如下：
（1）PERV-BM全基因克隆与序列分析
本研究通过改进方法，分三段扩增，获得两株PERV-BM全基因序列，即PERV-BM2和PERV-BM4；病毒全长分别8860bp和8850bp，均为PERV-A亚型，有完整的LTR和gag、pol、env结构基因。序列分析发现，PERV-BM与国内小型猪同源关系较近，为96.4%~97.3%。进一步分析发现，PERV-BM2和PERV-BM4的5’LTR中均存在2.5个39bp重复序列，二者均在病毒包装信号（ψ）的重要位点发生突变，另外，PERV-BM4在env基因的表面蛋白（SU）中存在无义突变和12bp基因片段缺失，可能导致多肽链合成提前终止，从而影响SU蛋白的活性和功能。基于病毒上述分子生物学特征，推测PERV-BM在感染性、病毒包装及转录水平均低于PERV-PK，尤其PERV-BM4。
（2）HEK293-PERV-BM细胞感染模型的构建
为了研究PERV-BM对人源细胞的感染、整合以及整合的影响，本研究构建PERV-BM感染人源细胞的HEK293-PERV-BM细胞感染模型。先后采集15头广西巴马小型猪前腔静脉血，分离PBMC，并分别在植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）和聚凝胺（polybrene）的刺激下，与HEK293细胞共培养，通过巢式PCR、RT-PCR和电镜观察，显示PERV-BM2成功感染HEK293细胞，建立了HEK293-PERV-BM细胞感染模型，而其他猪只来源PERV-BM均不能感染HEK293细胞；同时，用同样的方法建立HEK293-PERV-PK细胞感染模型。RT-PCR检测发现PERV-BM的转录水平低于PERV-PK。而且随着传代，PERV-BM发生变异，朝向PERV-PK和PERV-WZS方向发展，这可能是病毒为适应细胞做出的改变。
（3）PERV-BM在人类基因组中的整合及其特征分析
通过优化的LM-PCR和TAIL-PCR，分别从3875个和1483个克隆中鉴定出4个PERV-BM和157个PERV-PK整合位点。分析各自的整合特性，发现PERV-BM倾向通过截短或插入，造成leader基因直接与人类基因组相连，其整合位点远离基因的转录起始位点和CpG岛。PERV-PK更倾向于直接整合，少数为PERV-PK通过3’LTR的U5区与人类基因组相连，而且与其他γ反转录病毒类似，PERV-PK更倾向于整合到所整合基因的转录起始位点和CpG岛附近，检出率分别为35.03%和40.13%。经鉴定，二者有一个共同的整合位点，即3号染色体上ROBO2基因的3号内含子中。
（4）PERV-BM的整合对HERV-W表达的影响
本研究建立了HERV-W gag、pol、env和syncytin-1的qPCR检测方法，用于不同代次HEK293-PERV-BM中HERV-W各基因相对表达量的检测。
检测发现，PERV-BM整合会影响HERV-W gag、pol、env和syncytin-1mRNA水平，而且不同传代次数中各基因mRNA存在差异。其中P10左右，gag、pol、env和syncytin-1相对表达量开始升高，至P30代最高，达3.72%~37.27%，之后下降；Western Blot检测显示，各代次HEK293-PERV-BM细胞感染模型中syncytin-1蛋白表达量的改变与mRNA改变趋势一致，但变化程度较mRNA小。
此外，在对第1~55代HEK293-PERV-BM细胞感染模型中HERV-W gag、pol和env基因序列分析中发现，各代次HERV-W的gag基因无变异，pol基因和env基因均表现个别位点的点突变，未检出规律性变异以及基因片段的缺失、插入。
（5）PERV-BM的整合对细胞周期、细胞凋亡及相关基因表达的影响检测发现，PERV-BM的整合会造成HEK293细胞的细胞周期和细胞凋亡发生改变，而且这些改变与细胞感染模型的代次有关。为研究其机制，分别建立检测cylin D1、CDK4、c-myc、p53、p16和k-Ras的qPCR检测方法，检测不同代次HEK293-PERV-BM细胞感染模型中各基因mRNA相对表达量，并通过Western blot检测cylin D1、CDK4、c-myc等mRNA相对表达量变化较大基因的蛋白表达量的改变。
检测发现，P10代细胞感染模型的细胞周期被阻滞在S期和G2/M期，细胞凋亡受到抑制，根据相关基因的表达，推测可能通过Rb调控通路诱导低代次细胞模型细胞周期的改变；高代次的细胞周期主要被阻滞在S期、细胞凋亡增加，根据相关基因mRNA和蛋白表达水平的改变，推测高代次细胞周期的改变可能由Rb调控通路与p53调控通路协同诱导发生。
上述结果提示PERV的感染可能存在潜在的危险。
本研究分别从病毒基因结构和特征、感染、转录、整合以及整合后对HERV-W、细胞周期、细胞凋亡的影响等方面，对PERV-BM与宿主细胞相互作用机制进行系统研究，以期为系统地建立病毒安全评价体系，加快开发巴马小型猪，实现小型猪的产业化发展。