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研究背景邻苯二甲酸酯（Phthalates,PAEs）是地表分布最广泛的有机污染物之一,主要作为增塑剂应用于数百种产品中。PAEs作为环境激素类物质可以干扰人体的内分泌功能,长期暴露于PAEs会影响生殖健康,其中包括对于精液质量和性激素水平的影响。鉴于PAEs对健康的危害作用,世界各地对其广泛关注并分别制定了人类摄入量的安全限值。例如美国环保署（Environmental Protection Agency,EPA）制定的参考剂量（Reference doses,RfD）、欧洲食品安全局（European Food Safety Authority,EFSA）制定的每日可容忍摄入量（Tolerable Daily Intakes,TDI）、我国国家食品安全风险评估中心制定的健康指导值等。其中EPA的RfD相对比较严格且全面。然而,现有PAEs的安全限值在生殖损害方面考虑相对较少且缺少人群研究数据的支撑,因此需要结合人群研究,探究现有安全限值在保护男性生殖健康上是否有效。随着研究的深入,科学家们逐渐认识到男性生殖健康受包括环境、心理、行为等多方面因素的调控。无论地方人员还是军队等特殊人群均是如此。现有观点认为单一因素对男性生殖损害的影响较小,而联合多维暴露因素可能更有利于预测男性生殖损伤风险。然而,以往的研究主要是探究单暴露因素和单结局指标间的关联,可能增加研究的发表偏倚。其次,传统的统计方法难以整合多维暴露因素对男性生殖指标进行综合评价。现有资料显示,国内外综合考量多维暴露因素全面评价男性生殖损伤状况的研究方法仍缺乏。为解决上述问题,本研究基于课题组前期建立的重庆市男性大学生生殖健康调查（Male Reproductive Health in Chongqing College Students,MARHCS）人群,探究低剂量PAEs及环境等复杂暴露与男性生殖损害的关系。首先,采用最优尺度回归和Joinpoint模型方法,探究具有RfD的PAEs与男性精液常规参数和性激素水平的关联和阈剂量。其次,采用graph-guided fused lasso（GFLASSO）模型探究包括PAEs在内的环境-心理-行为多维暴露因素与多种男性生殖指标的关联,通过多维暴露因素构建各生殖指标的预测模型。进而基于上述模型,采用层次聚类识别人群中具有不同生殖损害特征的亚群并分析PAEs在不同亚群中的分布特征。研究内容1.低剂量PAEs与精液参数和性激素水平的关联研究及RfD水平下PAEs的男性生殖损害风险评估本研究的研究对象是MARHCS人群在2013年6月招募的796名男性大学生志愿者,采集了研究对象血液、尿液和精液样本。根据《WHO人类精液检验与处理实验室手册》（2010第5版）的要求收集志愿者精液样本并进行精子总数、前向运动和正常形态率等精液常规参数的检测。采用全自动免疫分析仪检测志愿者静脉血中6种性激素:雌激素、卵泡刺激素、黄体生成素、泌乳素、孕酮、睾酮。收集志愿者的中段尿样本,采用高效液相色谱串联质谱（High Performance Liquid Chromatography-tandem mass Spectrometry,HPLC-MS/MS）法对尿液中PAEs代谢产物的浓度进行检测。为进行RfD水平下PAEs的男性生殖损害的风险评估,采用最优尺度回归模型分析探究4种具有RfD的PAEs对应的7种代谢产物（MEP、Mn BP、MBz P、MEHP、MEOHP、MECPP、MEHHP）与精液参数和性激素水平的关联,通过Joinpoint模型识别PAEs与生殖指标关系中是否存在拐点（阈剂量）。对具有阈剂量的PAEs,采用Wittassek等提出的方法计算相应的外暴露水平,并与RfD比较,进行RfD的男性生殖损害风险评估。2.环境/行为/心理因素等多维暴露情况下PAEs与精液参数和性激素水平的关联分析为综合分析复杂暴露情况下PAEs与精液参数和性激素水平的关联,通过问卷调查、生物标志物检测和物理测量方法,调查上述志愿者的生殖健康状况及潜在的影响因素。主要收集了包括PAEs在内的环境、心理、行为等多维暴露因素共138项,测量了包括精液参数和性激素水平、精子染色质结构在内的32项生殖指标。采用GFLASSO模型综合分析每一种暴露因素与生殖指标的关系,筛选标准化回归系数正值最大的2.5%和负值最小的2.5%共220项,构建了对于每一种生殖指标的预测模型。基于上述预测模型,采用层次聚类和T-distributed stochastic neighbor embedding（t-SNE）方法将人群分为不同亚群,探究PAEs在精液质量或性激素水平异常亚群中的水平。研究结果1.低剂量PAEs与精液参数和性激素水平的关联研究及RfD水平下PAEs的男性生殖损害风险评估MARHCS人群中BBz P检出率较低,其余三种PAEs（DEP、Dn BP、DEHP）的暴露水平总体远低于各安全限值:高于RfD的比例分别为0%、0.8%和1.6%;高于Dn BP和DEHP的每日可容忍摄入量（Tolerable Daily Intakes,TDI）的比例分别为2.3%和0.6%;高于DEP、Dn BP、DEHP的健康指导值的比例分别为0.2%、2.3%和0.6%。7种PAEs的代谢产物与性激素和精液常规参数共有12种关联,其中DEP的代谢产物MEP与精子前向运动、正常形态率和睾酮水平相关（P<0.01）;Dn BP的代谢产物Mn BP与正常形态率相关（P<0.05）;DEHP的4种代谢产物中,MEHHP和MECPP与雌激素水平相关（P<0.05）、MEOHP和MEHP与雌激素和孕酮水平相关（P<0.01）、DEHP总代谢产物与孕酮和雌激素水平相关（P<0.01）。上述关联中,仅DEHP的代谢产物与部分参数的关联中存在拐点。拐点处反推的DEHP外暴露水平低于EPA的RfD（20μg/（kg·d））。2.环境/行为/心理因素等多维暴露情况下PAEs对精液常规参数和性激素水平的关联分析采用GFLASSO的方法分析多维暴露和多种生殖指标的关联。结果提示,各生殖指标均与多种暴露因素相关,在PAEs暴露低于RfD的人群中得出的结果与总体人群基本一致。筛选GFLASSO回归系数正值最大的2.5%和负值最小的2.5%,共220项暴露-结局的关联。其中,PAEs与生殖指标间共存在32项关联。根据筛选出的220项暴露-结局关联搭建各生殖指标的预测方程,预测结果与真实指标之间均呈正相关。通过构建的预测方程可以识别研究人群中存在5个具有不同生殖损伤特征的亚群,分别为（1）精子数量少和精子形态异常;（2）精子DNA碎片化程度较高;（3）精子染色质高染色性;（4）性激素水平异常;（5）精子DNA链断裂等五种。亚群4表现为雌激素和孕酮水平的异常,且PAEs总代谢物的暴露水平为5个亚群中较高。结论:本研究基于MARHCS人群,探究了DEHP等具有RfD的PAEs与精液常规参数和性激素水平的关联和阈剂量。PAEs的代谢产物与性激素水平和精液参数存在12种关联,DEHP与孕酮和雌激素水平的关联存在拐点,对应的人群中外暴露水平远低于RfD,而其它PAEs未发现拐点且在低剂量下仍与性激素水平和精液参数相关,提示PAEs对于男性精液参数和性激素水平可能存在影响,现有的安全限值在保护男性生殖健康方面可能存在不足。在此基础上,通过GFLASSO方法探究多维暴露情况下PAEs等多维暴露因素与精液参数和性激素水平的关联,成功构建了基于多维暴露因素的生殖指标预测模型,且能用于识别人群中具有不同生殖损伤特征的亚群。本研究提出了基于多维暴露因素综合评估人群生殖损伤特征的新方法,对社区男性生殖损伤的防护具有重要的参考价值,同时对保障军人的生殖健康也具有一定的借鉴意义。