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本研究以奶山羊子宫内膜上皮细胞(EEC)为研究对象,构建双荧光素酶报告载体验证miR-182与NTS和TES的靶向关系,用Real-time PCR、Western Blot等方法研究miR-182对基因NTS、TES和Caspase-8、p38表达量的影响。构建pcDNA3.1(+)过表达载体,研究NTS和TES的相互作用、对Caspase-8和p38蛋白表达量以及对子宫内膜上皮细胞凋亡的影响。主要研究结果如下:1.验证mi R-182与NTS和TES的靶向调节关系生物信息学预测发现奶山羊NTS基因3’UTR存在mi R-182靶位点,TES基因CDS区存在miR-182靶位点。构建双荧光素酶报告载体,分别与miR-182模拟物、Negative control(NC)共转染到293T细胞中。结果表明,与对照组NC相比,miR-182模拟物显著抑制了荧光素酶活性,表明miR-182通过与NTS-3’UTR相互作用导致荧光素酶活性降低(P<0.05),与TES基因CDS区相互作用导致荧光素酶活性降低(P<0.05)。据此,本研究初步鉴定NTS和TES为miR-182的靶基因。2.验证mi R-182对NTS、TES、Caspase-8、p38表达量的影响采用Real-time PCR和Western Blot技术检测NTS和TES基因的表达水平。结果表明,与对照组相比,miR-182在mRNA和蛋白水平均显著抑制靶基因NTS和TES的表达(P<0.05)。采用Western Blot技术发现mi R-182显著增加了Caspase-8的蛋白表达量(P<0.05),减少了p38的蛋白表达量(P<0.05)。3.检测NTS和TES对Caspase-8、p38表达量的影响构建pcDNA3.1(+)-NTS和pcDNA3.1(+)-TES过表达载体并转染EEC,采用Western Blot技术检测Caspase-8和p38表达量,并与对照组相比。结果显示过表达NTS和TES显著降低了Caspase-8蛋白表达量(P<0.05),增加了p38的蛋白表达量(P<0.05)。这一结果与miR-182对Caspase-8、p38表达量的影响结果相反。4.验证NTS和TES的相互作用和对EEC凋亡的影响将pcDNA3.1(+)-NTS和pcDNA3.1(+)-TES过表达载体转染EEC,通过Real-time PCR和Western Blot技术检测NTS和TES基因的表达水平。结果发现过表达NTS显著抑制了TES mRNA和蛋白水平表达量(P<0.05)。而过表达TES基因只减少了NTS蛋白的表达量(P<0.05),对NTS mRNA没有显著影响(P>0.05)。用流式细胞仪检测pcDNA3.1(+)-NTS和pcDNA3.1(+)-TES对EEC凋亡的影响,结果表明NTS和TES均显著抑制了EEC凋亡(P<0.05)。以上结果表明,NTS和TES为miR-182的靶基因,mi R-182可能通过下调NTS和TES,上调Caspase-8而影响奶山羊子宫内膜上皮细胞的凋亡。