论文部分内容阅读
目的1检测可变剪接体OSTα2在不同动物(家兔、小鼠、大鼠)和人的组织表达谱;检测胆汁淤积或者胆汁酸负荷时,以及肥胖和高脂饮食引起的脂代谢异常时OSTα与OSTα2的表达改变。2检测可变剪接体OSTα2对OSTα与OSTβ的相互作用及膜定位的影响。方法1利用PCR、半巢式PCR定性检测不同动物和人组织中OSTα和OSTα2的表达情况;利用实时定量PCR检测胆管结扎或口服胆汁酸负荷时,以及肥胖和高脂饮食引起的脂代谢异常时小鼠回肠OSTα及OSTα2的表达改变。2利用PCR技术扩增小鼠OSTα、OSTα2和OSTβ的编码序列,克隆到表达载体pc DNA3.1(-)中。基因编码序列克隆入载体p Bi FC-VC155和p Bi FC-VN155以进行Bi FC分析,克隆入p EGFPN2构建GFP融合蛋白。利用Bi FC和GFP融合蛋白分析蛋白的相互作用与膜定位。结果1 PCR定性检测显示OSTα和OSTβ在所有检测组织中均有表达,OSTα2在除卵巢外的所有检测组织表达。提取各组小鼠回肠RNA,逆转录后实时定量PCR分析显示:胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)后OSTα、OSTα2及OSTβ的表达水平在3天(BDL3d)组均显著降低,OSTβ的表达水平在BDL7d组也明显降低;牛磺胆酸(taurocholate acid,TCA)处理后,OSTα在TCA10d和TCA20d表达水平显著升高,而OSTα2及OSTβ的表达水平仅在TCA10d组明显升高;消胆胺(cholestyramine,CY)处理组变化不明显;与对照的db/m小鼠相比,db/db小鼠回肠OSTα和OSTα2的m RNA表达水平均升高;高脂饮食喂养3个月所致的营养性肥胖小鼠,实时定量PCR结果显示OSTα在回肠的表达显著高于对照组;回肠OSTα2表达水平没有明显改变。2利用Bi FC技术和GFP融合蛋白分析,共聚焦显微镜下结果显示:OSTα和OSTβ共表达绿色荧光定位于细胞膜;OSTα2单独表达形成的同源二聚体定位于胞浆;OSTα2和OSTβ可形成异二聚体,但绿色荧光定位于胞浆中;OSTα和OSTβ中加入等量OSTα2后,绿色荧光主要定位于细胞浆中。结论1胆总管结扎小鼠回肠OSTα、OSTα2及OSTβ表达降低,而胆汁酸负荷小鼠回肠的OSTα、OSTα2及OSTβ表达增加。2 OSTα2通过与OSTα竞争结合OSTβ,干扰OSTα-OSTβ复合物的形成以及亚细胞定位和功能,表现为显性负效应。