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对虾是重要的水产养殖种类之一,由于各类病害的爆发,特别是白斑综合症的威胁,对虾养殖产业经受了巨大的损失。对虾抵御病原侵袭的方式是启动先天免疫应答系统,特别是通过信号通路的启动完成对病原的识别和清除。已有研究表明,对虾先天免疫系统中两条重要的信号通路:Toll通路和JAK/STAT通路可能参与了对虾应答白斑综合症病毒的过程。然而,有关对虾Toll通路的关键接头分子MyD88的功能尚未报道,JAK/STAT通路的转录因子STAT在对虾感染WSSV过程中的功能尚不清楚。基于上述问题,本文对对虾的MyD88和STAT在WSSV侵染过程中的作用进行了研究,研究进展如下:1.从中国明对虾中克隆获得了MyD88的同源基因---FcMyD88,其cDNA全长1434bp,编码477个氨基酸。推导的氨基酸序列中包含死亡结构域(deathdomain,DD)和TIR结构域(typical TLR and IL-1R-related,TIR),在其C端有一段约100个氨基酸组成的C端延伸区域(C-terminal extension,CTE)。定量PCR和免疫印迹分析发现,FcMyD88mRNA在藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后的24小时内均上调表达;FcMyD88蛋白在V. anguillarum刺激的12小时上调表达,而在M. luteus刺激后无明显变化;FcMyD88mRNA虽然在WSSV刺激后表达量相对稳定,但是FcMyD88蛋白在WSSV刺激后明显上调表达;用WSSV感染MyD88沉默后的对虾,由WSSV感染引起的对虾死亡率显著降低。以上结果表明MyD88依赖的信号通路参与了对虾抵御细菌和WSSV感染过程,MyD88可能有利于WSSV的感染。2.利用dsRNA干扰技术沉默对虾STAT基因后再感染WSSV,观察WSSV在对虾中的拷贝数和由WSSV感染引起的对虾死亡率,结果表明,在STAT基因沉默后的对虾中,WSSV拷贝数维持在102-103copies/ng DNA,显著少于对照组,并且其死亡率也显著低于对照组。为进一步了解STAT基因的功能,又利用培养的螯虾造血细胞进行了研究,利用STAT3特异抑制剂(S3I-201)抑制鳌虾造血细胞的STAT活性后再用WSSV感染细胞,其细胞存活率显著高于未经抑制剂处理的对照组,说明STAT在WSSV感染对虾的过程中起着重要作用。为了解在STAT干扰后的对虾中STAT通路可能调控的目的基因以及RNAi调控通路的相关基因的表达,利用实时定量PCR技术对STAT干扰后的对虾中相关基因的表达进行了分析,结果表明,与注射EGFP双链RNA的对照组相比,在STAT被干扰的对虾中再感染WSSV后,GILT, Dicer2和AGO2基因的表达明显上调,而AGO1和Dicer1基因的表达没有发生明显变化,说明STAT被干扰后的对虾可能通过增强siRNA通路达到抗WSSV感染的目的。3.利用高通量的RNA-seq技术筛选STAT被干扰的对虾中差异表达的基因,结果表明,STAT干扰引起了参与能量代谢、糖代谢、外骨骼组成、转录及免疫等生命过程的基因表达的变化。其中,与能量代谢相关酶类,如腺苷酸环化酶、细胞色素c氧化酶I亚基;外骨骼组成相关蛋白,如Culticle、DD5、DD9A;转录相关分子,如转录起始因子TFIID和RNA解旋酶等基因的表达均下调。而与糖代谢相关分子、免疫相关分子等的表达既有上调也有下调,说明STAT干扰改变了对虾体内许多基因的转录表达,这些基因的表达变化可能不利于WSSV在对虾体内的复制。本研究筛选的对虾STAT潜在调控的基因信息,为进一步分析JAK/STAT对虾免疫中的功能奠定了重要基础。