研究目的： 1、动态观察PBMCs中GR蛋白水平数量，了解临床上症状加重和或GC疗效不佳的原因，指导临床合理用药。 2、从蛋白水平和mRNA水平对GR的表达进行观察，判断疗效的差异是否与受体翻译水平和或受体转录水平异常有关。 3、比较不同类型MS患者内源性皮质醇浓度的变化及其与GR的关系。 4、观察用药前后EDSS的变化是否与GR蛋白表达水平相关。 材料与方法： 1、临床资料 1.1、病例来源 35例MS患者(包括：复发缓解型MS、继发进展型MS)、9例视神经脊髓炎患者和10例临床孤立综合征患者均选自2005年3月～2006年1月于中山大学附属第三医院就诊的住院患者。45例健康对照为广州市中心血站的自愿献血者。病例组和对照组性别与年龄均无显著性差异。 1.2、病例入选标准 传统型MS诊断标准符合McDonald等2001年提出的诊断标准；NMO患者符合Wingerchuk等1999年提出的NMO诊断标准；CIS患者系排除了其他疾病的临床具有MS的特征性表现，无MRI阳性表现或是轻微的脱髓鞘表现。1.3、标本采集 于GC冲击治疗前(采血前3个月内未使用过免疫抑制剂，GC应用者美卓乐用量不多于24mg/d)、治疗中(冲击治疗第4天)、治疗后第14天上午6-8时取静脉血；健康对照组早8时抽取静脉血；分别进行GR、GRmRNA及血浆空腹皮质醇检测。 1.4、结果判断标准 指标正常值 空腹皮质醇浓度早晨空腹190.2～618.Onmol/L； GR蛋白数量3000-6000(位点/细胞) GRmRNA电泳结果使用凝胶成像分析系统(型号：UVPGDS-8000)进行灰度分析。 2、实验材料与仪器 2.1、放射配体结合法测定GR蛋白水平数量： 2.1.1、主要试剂与材料： 磷酸盐缓冲液PBS(pH：7.2～7.4)、超纯水系统、淋巴细胞分离液、二甲苯、PPO(进口分装)第一闪烁液、POPOP(进口分装)第二闪烁液、[3H]Dex、非标地塞米松、肝素抗凝硅化管、49型玻璃纤维滤膜、移液枪。 2.1.2、主要仪器： 酸度计(PH计)、倒置显微镜、震荡水浴箱、多头细胞收集器、液体闪烁计数器、烘箱、台式高速冷冻离心机。 2.2、RT-PCR法测定GRmRNA的表达： 2.2.1、主要试剂与材料： 磷酸盐缓冲液PBS(pH：7.2～7.4)，酸度计(PH计)、超纯水系统、淋巴细胞分离液，总RNA提取试剂盒(TRIzol)，氯仿(无RNA酶)、100％异戊醇(无RNA酶)、100％无水乙醇(无RNA酶)，DEPC，RNA逆转录试剂盒，PCR试剂盒、上样液(Gelloadingbuffer)、DNAMarker、15ml塑料离心管；1ml、0.5ml、0.2mlEP管，1ml、200ul、10ul枪头；1ml、200ul、10ul移液枪；滤纸；制胶模具；琼脂糖。 2.2.2、主要仪器 超净工作台，大容量低速离心机，小型高速离心机，漩涡混合器，台式高速冷冻离心机；核酸蛋白分析仪；电泳仪；电泳槽；凝胶成像分析系统。 2.3、空腹皮质醇的检测 使用皮质醇磁性分离酶联免疫测定法试剂盒进行检测。 3、实验方法与步骤 3.1、GR蛋白测定的实验方法与步骤： 使用放射配体结合法检测。首先分离3ml肝素抗凝血中的单核细胞，用PBS液(PH=7.4)将分离出的细胞调成106个/ml悬液，将该悬液分成两管，一管加等量[3H]Dex15mol/L作为总结合管(TB)，另一管加等量的[3H]Dex，再加2000倍非标Dex为非特异结合管(NSB)。置30℃震荡水浴箱中30分钟，冰冻蒸馏水滴入试管终止反应，用多头细胞收集器抽提，加闪烁液4ml(含二甲苯、POP、POPOP)过夜待测，将闪烁杯移至液体闪烁计数器计数测量。每种管均设有两个平行管，所测出的数据行平均处理。 3.2、GRmRNA检测的方法与实验步骤： 利用半定量RT-PCR法检测，首先分离新鲜静脉血中的PBMCs并作细胞计数及细胞活力检测；提取PBMCs中总RNA，电泳验证RNA的完整性；将RNA逆转录为cDNA；合成目的基因及内参基因引物；应用聚合酶链反应扩增目的基因；利用电泳技术分离目的条带并进行半定量分析。 3.3空腹皮质醇的检测： 送我院内分泌实验室进行检测，步骤略。 4、统计及分析方法 使用MicrosoftExecel2003制图、SPSS11.5forwindows统计分析软件进行数据统计处理。首先对计量资料进行正态分布检验，符合正态分布的计量资料数据以均数±标准差(-x±s)表示，用F检验进行两样本方差齐性检验，当两独立样本符合正态分布且方差齐时，两组均数间比较采用t检验，方差不齐时采用校正t检验；对治疗前中后的所得数据进行配对样本t检验，以P≤0.05作为有显著性差异。对不同观测指标间是否存在线性关系，使用Pearson相关系数检验。 结果： 1、RRMS、SPMS患者治疗前PBMCs中GR蛋白数量显著低于健康对照组，治疗后RRMS患者的GR蛋白数量与健康对照组无显著性差异，SPMS患者GR蛋白数量仍显著低于健康对照组；NMO和CIS患者治疗前、后PBMCs中GR蛋白数量与健康对照组均无显著性差异。 2、各组患者在GC冲击治疗中GR蛋白数量均有显著性下降。 3、各组患者血浆皮质醇浓度在治疗前、后与对照组均无显著性差异。 4、RRMS和NMO患者治疗后EDSS较治疗前显著下降，SPMS患者EDSS治疗前后无显著变化。 5、RRMS患者治疗前后GR蛋白数量和EDSS存在线性负相关。 6、MS患者治疗前GR蛋白数量与治疗前后EDSS的差值无相关性。 7、RRMS患者PBMCs中GRαmRNA的表达与健康对照组无显著性差异，SPMS患者PBMCs中GRαmRNA的表达显著低于健康对照组。 8、RRMS、SPMS患者PBMCs中GRβmRNA的表达水平均显著高于健康对照组，SPMS患者的GRβmRNA表达水平显著高于RRMS患者。 9、RRMS、SPMS患者PBMCs中GRβmRNA的表达分别占相应GRαmRNA的43.98±10.75％和140.01±192.90％。SPMS患者治疗前GRβmRNA表达水平与治疗前后EDSS的差值呈线性负相关。 结论： 1、MS患者体内的GC产生和代谢正常，GR蛋白数量异常，提示MS患者可能存在GC-GR系统功能紊乱，GR降低可能与MS的发生和发展有关。 2、GC冲击治疗中，症状一过性加重与GR蛋白数量显著性下降相关，RRMS患者GR蛋白数量与EDSS相关。 3、GRαmRNA的表达水平显著降低和或内源性抑制因子GRβmRNA表达水平显著升高可能是导致MS患者功能性受体蛋白数量减少的原因之一。 4、GRβmRNA相对低水平表达可能对GR蛋白活性无明显影响。 5、MS患者PBMCs中GRmRNA表达水平的变化可以提示GR的活性状态，GR功能性蛋白数量的检测是预测临床GC疗效的客观指标。