论文部分内容阅读
研究目的:
1、动态观察PBMCs中GR蛋白水平数量,了解临床上症状加重和或GC疗效不佳的原因,指导临床合理用药。
2、从蛋白水平和mRNA水平对GR的表达进行观察,判断疗效的差异是否与受体翻译水平和或受体转录水平异常有关。
3、比较不同类型MS患者内源性皮质醇浓度的变化及其与GR的关系。
4、观察用药前后EDSS的变化是否与GR蛋白表达水平相关。
材料与方法:
1、临床资料
1.1、病例来源
35例MS患者(包括:复发缓解型MS、继发进展型MS)、9例视神经脊髓炎患者和10例临床孤立综合征患者均选自2005年3月~2006年1月于中山大学附属第三医院就诊的住院患者。45例健康对照为广州市中心血站的自愿献血者。病例组和对照组性别与年龄均无显著性差异。
1.2、病例入选标准
传统型MS诊断标准符合McDonald等2001年提出的诊断标准;NMO患者符合Wingerchuk等1999年提出的NMO诊断标准;CIS患者系排除了其他疾病的临床具有MS的特征性表现,无MRI阳性表现或是轻微的脱髓鞘表现。1.3、标本采集
于GC冲击治疗前(采血前3个月内未使用过免疫抑制剂,GC应用者美卓乐用量不多于24mg/d)、治疗中(冲击治疗第4天)、治疗后第14天上午6-8时取静脉血;健康对照组早8时抽取静脉血;分别进行GR、GRmRNA及血浆空腹皮质醇检测。
1.4、结果判断标准
指标正常值
空腹皮质醇浓度早晨空腹190.2~618.Onmol/L;
GR蛋白数量3000-6000(位点/细胞)
GRmRNA电泳结果使用凝胶成像分析系统(型号:UVPGDS-8000)进行灰度分析。
2、实验材料与仪器
2.1、放射配体结合法测定GR蛋白水平数量:
2.1.1、主要试剂与材料:
磷酸盐缓冲液PBS(pH:7.2~7.4)、超纯水系统、淋巴细胞分离液、二甲苯、PPO(进口分装)第一闪烁液、POPOP(进口分装)第二闪烁液、[3H]Dex、非标地塞米松、肝素抗凝硅化管、49型玻璃纤维滤膜、移液枪。
2.1.2、主要仪器:
酸度计(PH计)、倒置显微镜、震荡水浴箱、多头细胞收集器、液体闪烁计数器、烘箱、台式高速冷冻离心机。
2.2、RT-PCR法测定GRmRNA的表达:
2.2.1、主要试剂与材料:
磷酸盐缓冲液PBS(pH:7.2~7.4),酸度计(PH计)、超纯水系统、淋巴细胞分离液,总RNA提取试剂盒(TRIzol),氯仿(无RNA酶)、100%异戊醇(无RNA酶)、100%无水乙醇(无RNA酶),DEPC,RNA逆转录试剂盒,PCR试剂盒、上样液(Gelloadingbuffer)、DNAMarker、15ml塑料离心管;1ml、0.5ml、0.2mlEP管,1ml、200ul、10ul枪头;1ml、200ul、10ul移液枪;滤纸;制胶模具;琼脂糖。
2.2.2、主要仪器
超净工作台,大容量低速离心机,小型高速离心机,漩涡混合器,台式高速冷冻离心机;核酸蛋白分析仪;电泳仪;电泳槽;凝胶成像分析系统。
2.3、空腹皮质醇的检测
使用皮质醇磁性分离酶联免疫测定法试剂盒进行检测。
3、实验方法与步骤
3.1、GR蛋白测定的实验方法与步骤:
使用放射配体结合法检测。首先分离3ml肝素抗凝血中的单核细胞,用PBS液(PH=7.4)将分离出的细胞调成106个/ml悬液,将该悬液分成两管,一管加等量[3H]Dex15mol/L作为总结合管(TB),另一管加等量的[3H]Dex,再加2000倍非标Dex为非特异结合管(NSB)。置30℃震荡水浴箱中30分钟,冰冻蒸馏水滴入试管终止反应,用多头细胞收集器抽提,加闪烁液4ml(含二甲苯、POP、POPOP)过夜待测,将闪烁杯移至液体闪烁计数器计数测量。每种管均设有两个平行管,所测出的数据行平均处理。
3.2、GRmRNA检测的方法与实验步骤:
利用半定量RT-PCR法检测,首先分离新鲜静脉血中的PBMCs并作细胞计数及细胞活力检测;提取PBMCs中总RNA,电泳验证RNA的完整性;将RNA逆转录为cDNA;合成目的基因及内参基因引物;应用聚合酶链反应扩增目的基因;利用电泳技术分离目的条带并进行半定量分析。
3.3空腹皮质醇的检测:
送我院内分泌实验室进行检测,步骤略。
4、统计及分析方法
使用MicrosoftExecel2003制图、SPSS11.5forwindows统计分析软件进行数据统计处理。首先对计量资料进行正态分布检验,符合正态分布的计量资料数据以均数±标准差(-x±s)表示,用F检验进行两样本方差齐性检验,当两独立样本符合正态分布且方差齐时,两组均数间比较采用t检验,方差不齐时采用校正t检验;对治疗前中后的所得数据进行配对样本t检验,以P≤0.05作为有显著性差异。对不同观测指标间是否存在线性关系,使用Pearson相关系数检验。
结果:
1、RRMS、SPMS患者治疗前PBMCs中GR蛋白数量显著低于健康对照组,治疗后RRMS患者的GR蛋白数量与健康对照组无显著性差异,SPMS患者GR蛋白数量仍显著低于健康对照组;NMO和CIS患者治疗前、后PBMCs中GR蛋白数量与健康对照组均无显著性差异。
2、各组患者在GC冲击治疗中GR蛋白数量均有显著性下降。
3、各组患者血浆皮质醇浓度在治疗前、后与对照组均无显著性差异。
4、RRMS和NMO患者治疗后EDSS较治疗前显著下降,SPMS患者EDSS治疗前后无显著变化。
5、RRMS患者治疗前后GR蛋白数量和EDSS存在线性负相关。
6、MS患者治疗前GR蛋白数量与治疗前后EDSS的差值无相关性。
7、RRMS患者PBMCs中GRαmRNA的表达与健康对照组无显著性差异,SPMS患者PBMCs中GRαmRNA的表达显著低于健康对照组。
8、RRMS、SPMS患者PBMCs中GRβmRNA的表达水平均显著高于健康对照组,SPMS患者的GRβmRNA表达水平显著高于RRMS患者。
9、RRMS、SPMS患者PBMCs中GRβmRNA的表达分别占相应GRαmRNA的43.98±10.75%和140.01±192.90%。SPMS患者治疗前GRβmRNA表达水平与治疗前后EDSS的差值呈线性负相关。
结论:
1、MS患者体内的GC产生和代谢正常,GR蛋白数量异常,提示MS患者可能存在GC-GR系统功能紊乱,GR降低可能与MS的发生和发展有关。
2、GC冲击治疗中,症状一过性加重与GR蛋白数量显著性下降相关,RRMS患者GR蛋白数量与EDSS相关。
3、GRαmRNA的表达水平显著降低和或内源性抑制因子GRβmRNA表达水平显著升高可能是导致MS患者功能性受体蛋白数量减少的原因之一。
4、GRβmRNA相对低水平表达可能对GR蛋白活性无明显影响。
5、MS患者PBMCs中GRmRNA表达水平的变化可以提示GR的活性状态,GR功能性蛋白数量的检测是预测临床GC疗效的客观指标。