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背景冷冻消融作为中晚期前列腺癌的治疗手段之一,在控制局部病灶方面取得显著疗效,在临床中得以广泛应用。我们在前期临床工作中发现冷冻消融治疗后部分前列腺癌患者远处肺转移灶自行消退,后续深入研究发现冷冻免疫可能参与这一过程。旁观者效应(bystander effect),最初源于基因治疗领域,即处理细胞的同时未处理细胞发生损伤,即损伤扩大效应。基因治疗、放射治疗及抗肿瘤药物等均被报道出现旁观者效应。近年来,动物实验研究中基因治疗和放射治疗导致的旁观者效应已被广泛报道,其可能机制如下:局部治疗可促使机体发生免疫炎症反应,通过氧化应激、ROS、NO合成及炎症相关信号通路等导致非治疗细胞发生损伤,也可通过胞内细胞释放危险信号可诱发机体识别肿瘤的能力,从而影响机体免疫微环境,进而激发机体抗肿瘤免疫反应,实现对非治疗区域的肿瘤细胞杀伤效应。据此,本研究旨在通过动物实验验证冷冻消融是否可诱导旁观者效应,探讨免疫炎症机制是否参与旁观者效应,以期为冷冻消融治疗恶性肿瘤提供新的增效方法,也为进一步提高肿瘤治疗效果提供理论和实验依据。目的构建双侧小鼠前列腺癌移植瘤模型,然后对单侧移植瘤行实验治疗,观察小鼠生存期、肺转移及对侧移植瘤的生长变化,从动物模型中验证冷冻消融是否诱导旁观者效应,并动态观察该过程中免疫细胞及炎症信号(Hsp70)的变化,初步阐释冷冻消融后诱导旁观者效应的相关机制。材料与方法1.构建小鼠双侧RM-1前列腺癌移植瘤模型,随机分为三组:对照组(A组)、手术组(B组)和冷冻消融组(C组),分别对右侧移植瘤予以假手术、手术切除和冷冻治疗处理,对侧(左侧)移植瘤不予处理。观察对侧(左侧)移植瘤生长变化,记录各组小鼠生存期。2.分别于术后7天、14天处死小鼠,留取外周血、脾脏、肺组织、肿瘤组织标本。HE染色观察肺转移情况,流式细胞术检测脾脏淋巴细胞中CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的数量及比例,并分析Th1/Th2比例变化。ELISA法检测各组小鼠血清中Hsp70的含量变化,免疫组化染色观察对侧肿瘤组织增殖指标Ki67的变化。蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测对侧肿瘤组织细胞内Hsp70表达情况。结果1.与A组(对照组)和B组(手术组)相比,C组(冷冻组)在7天、14天对侧肿瘤直径显著减小(P<0.05,P<0.05)。B组(手术组)与A组(对照组)对侧肿瘤直径在术后7天未见统计学差异(P>0.05),术后14天A组对侧肿瘤直径大于B组(P<0.05)。2.与A组(对照组)、B组(手术组)相比,C组(冷冻组)小鼠总体生存期(OS)明显延长(P<0.001,P<0.001);A组(对照组)与B组(手术组)总生存期未见统计学差异(P=0.342)。3.三个治疗组小鼠肺转移率随时间推移呈逐渐升高趋势。治疗后7天三组肺转移率未见统计学差异(P=0.562);治疗后14天,C组(冷冻组)转移率显著低于A组(对照组)和B组(手术组),差异有统计学意义(P<0.05)。4.随着时间推移,C组(冷冻组)CD4+T细胞比例呈上升趋势,A组(对照组)和B组(手术组)中呈下降趋势;与A组(对照组)和B组(手术组)相比,C组(冷冻组)在治疗后7天、14天CD4+T细胞比例显著增加(P<0.05、P<0.05)。5.随时间推移,C组(冷冻组)、B组(手术组)中CD8+T细胞比例呈上升趋势,在A组(对照组)中呈下降趋势;与A组(对照组)和B组(手术组)相比,C组(冷冻组)在7天、14天CD8+T细胞比例显著增加(P<0.05、P<0.05)。6.随时间推移,三组NK细胞比例均呈先下降后上升趋势;与B组(手术组)相比,A组(对照组)、C组(冷冻组)在7天NK细胞比例略有增加(P=0.002、P<0.001);在14天与A组(对照组)、B组(手术组)相比,C组(冷冻组)NK细胞比例显著增加(P=0.003、P=0.001)。7.随时间推移,C组(冷冻组)Th1/Th2比值呈上升趋势,A组(对照组)和B组(手术组)中呈下降趋势;与A组(对照组)和B组(手术组)相比,C组(冷冻组)在7天、14天Th1/Th2比值均显著增加(P<0.05、P<0.05)。8.随时间推移,C组(冷冻组)CTL细胞杀伤活性呈上升趋势,A组(对照组)和B组(手术组)中呈下降趋势;与A组(对照组)和B组(手术组)相比,C组(冷冻组)在7天、14天CTL细胞杀伤活性均显著增加(P<0.001、P<0.001)。9.随时间推移,C组(冷冻组)对侧肿瘤细胞增殖活性(Ki67)呈先下降后上升趋势,A组(对照组)和B组(手术组)呈先上升后下降趋势;与A组(对照组)和B组(手术组)相比,C组(冷冻组)在7天、14天对侧肿瘤细胞增殖活性(Ki67)显著下降(P<0.05、P<0.05),其他两组间相比无明显变化(P>0.05)。10.随时间推移,三组小鼠血清Hsp70含量均呈先上升后下降趋势;与A组(对照组)和B组(手术组)相比,C组(冷冻组)在7天、14天小鼠血清Hsp70含量显著增加(P<0.01、P<0.01);其他两组组间比较未见统计学差异(P>0.05)。11.随时间推移,C组(冷冻组)肿瘤细胞内中Hsp70表达量均呈有下降趋势,A组(对照组)和B组(手术组)呈上升趋势;与A组(对照组)和B组(手术组)相比,C组(冷冻组)在7天、14天肿瘤细胞内Hsp70表达量呈下降趋势。结论1.冷冻消融治疗可减缓对侧移植瘤生长速率,降低小鼠肺转移发生率,延长小鼠生存期,提示冷冻消融治疗前列腺癌后可诱导旁观者效应。2.冷冻消融可诱导机体CD4+Th1优势免疫反应,并增强CD8+CTL细胞杀伤活性,抑制对侧肿瘤生长3.冷冻后外周血Hsp70表达升高可能参与了冷冻免疫反应调节