肿瘤是人类健康的重大威胁，而探索抗肿瘤新疗法则是个世界性难题。近来，大量研究集中于抗肿瘤免疫和抗肿瘤血管发生两个方面，这些新方向的提出对于临床实施抗肿瘤治疗新疗法具有积极意义。肿瘤抗原能刺激机体产生不同类型的抗肿瘤免疫应答，进而产生抗肿瘤的细胞免疫和体液免疫，直接决定肿瘤患者的预后。抗肿瘤免疫的意义就在于积极调动免疫细胞以及非免疫细胞功能而使肿瘤发生始终处于可控状态。肿瘤体积小于2-3mm3时，瘤细胞通过周边弥散的方式获得营养支持而缓慢生长，当瘤体继续增大则需要新生血管来支持生长。抗肿瘤血管发生的意义就在于通过抑制血管发生或者使新生血管功能缺陷，或可达到抑制肿瘤生长目的。Notch信号是经典而保守的发育调控通路，细胞间Notch受体和配体相互结合后，Notch受体胞内段经酶切后脱离细胞内表面并进入细胞核，在细胞核内与DNA结合蛋白RBP-J相互作用，使转录共抑制物变为转录共激活物，从而启动含有RBP-J识别位点的启动子转录，进而调节相关的下游基因表达。Notch信号参与免疫细胞发育调控，如T细胞、B细胞、DC细胞、髓系细胞以及它们的亚群细胞的分化、成熟。近年来研究发现，一些非免疫细胞也具有调节免疫细胞功能，比如MSCs在抗肿瘤免疫中也具有重要作用，不仅可以利用MSCs的―归巢‖性，靶向性的集中在肿瘤灶周围，还可以调动免疫系统对肿瘤细胞进行直接杀伤。间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）作为新一代生物抗免疫治疗方法已经初步进入临床，如将MSCs注入移植物抗宿主免疫病（Graft Versus HostDisease，GVHD）患者体内，可以有效降低宿主的免疫排斥反应。此外，Notch信号在成年个体和胚胎血管发育中具有不可替代的作用，尤其在动静脉分化、Tip/stalk细胞分化、血管内皮细胞增殖、迁移及伪足形成以及维持成年个体血管稳定性等方面都发挥调控作用。因此Notch信号成员近来成为肿瘤血管干预的候选靶位之一。离体情况下研究Notch信号对细胞的效应，主要通过外源表达配体并刺激细胞的方式来进行。目前，几种可溶性的抗Notch受体的抗体已经被建立，这些抗体通过中和作用阻断Notch信号进而影响正常肿瘤血管发生，但目前仍存在副作用大、成本高、药效不稳等缺点。因此新的Notch信号天然抑制剂的研发具有实际意义。据此，我们进行如下研究：1.分析Notch信号在MSCs治疗移植物抗宿主病中的重要意义。采用异基因骨髓移植法建立小鼠GVHD模型。γ射线辐照BALB/c小鼠，分别将分离于正常C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs）、Notch信号缺失的C57BL/6小鼠BMSCs，以静脉注射方式注射辐照小鼠，观察辐照小鼠生存时间，并观察相关细胞表面分子以及细胞因子变化情况，分析Notch信号在BMSCs免疫调节中的作用。结果显示，供体BMSCs具有抑制受体免疫排斥反应的作用。而当BMSCs中Notch信号缺失时，免疫抑制功能减弱，移植物抗宿主病病程重新加剧。Notch信号在BMSCs中的功能主要是抑制T细胞的增殖和激活，同时抑制DC细胞中MHC II、共刺激分子CD80和CD86的表达。研究证实，BMSCs的免疫抑制作用主要是通过IL-6和PGE2完成的，而这两个分子受Notch信号调控。2.大肠杆菌表达系统表达重组人Delta-like4（human delta-like4, hDll4）不同截短体蛋白。PCR法分别克隆hDll4的DSL结构域、DSL结构域与其后的1个EGFR、DSL结构域与其后的2个EGFR（DOS结构域）以及DOS结构域四个片段。测序后连入原核表达载体pET32a(+)，新构建hDll4-DSL、 hDll4-DSL-EGFR、hDll4-DSL-EGFR2以及hDll4-EGFR2四个原核表达载体。同时构建含有RGD序列的以上四种hDll4截短体的原核表达载体。转化大肠杆菌BL21，IPTG于25℃低温诱导表达24h，裂菌后收集裂解上清，纯化浓缩并定量。使用报告基因实验、Notch下游基因的Real-time PCR以及MTT方法证实：可溶性含DSL结构域的hDll4截短体蛋白具有抑制Dll4/Notch信号的作用，抑制功能无明显差异，而RGD序列对于hDll4截短体蛋白的抑制功能则没有影响。3.真核表达系统293T细胞系中表达重组hDll1、hDll4、hJag1截短体蛋白。并验证其对血管内皮细胞的功能。PCR法分别克隆hDll1、hDll4、hJag1的NT区+DSL结构域以及NT区+DSL结构域+DOS结构域两个片段。测序后连入带有RGD序列的改建载体pEF-BOS-Neo-RGD-His中，构建分别含hDll4-DSL、hDll4-DSL-EGFR2、hDll1-DSL、hDll1-DSL-EGFR2、hJag1-DSL、hJag1-DSL-EGFR2片段的真核表达载体。通过Notch下游基因的Real time PCR和FACS证实hDll1、hDll4、hJag1不同截短体均具有激活Notch信号的作用，尤以DSL-EGFR2的形式最为显著。同时，三者的激活作用存在差异，推测HUVEC表达某些特异性的Notch受体，因此对配体的反应性存在差异。