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目的: Exosomes（外来体）是一种包含了至少10种必要组分的蛋白复合物,能激发体内外CD8+ T细胞依赖的抗肿瘤反应,已成为一种新型亚细胞肿瘤疫苗。为了提高Exosomes的产量,增强其抗肿瘤作用,使其成为一种新型高效的肿瘤疫苗,本研究通过提取小鼠肝癌细胞H22分泌的Exosomes及小鼠肝癌细胞H22经热休克后分泌的Exosomes （HS-Exo）并分析两者的蛋白组成成分,在BALB/c荷瘤小鼠观察热休克处理对Exosomes激发宿主抗肝癌免疫应答效应的影响,研究其可能机制,希冀为具有抗肿瘤作用的新型高效的肿瘤疫苗的研制提供新思路。方法:1.热休克小鼠肝癌细胞(H22):取生长状态良好的小鼠肝癌细胞株(H22),将其置于43℃水浴箱热休克2小时,再放入37℃、5% CO2孵育箱恢复4小时,收取培养上清。2.小鼠肝癌细胞(H22)来源的Exosomes及HS-Exo的制备及其免疫相关蛋白的分析:采用超速分级离心和蔗糖密度梯度离心提取纯化Exosomes及HS-Exo,经透射电镜观察鉴定两者的形态大小;Bradford法分别定量Exosomes及HS-Exo;运用免疫印迹法（Western blot）分别检测对比Exosomes及HS-Exo含有的蛋白成分。3.小鼠肝癌细胞(H22)来源的Exosomes及HS-Exo激发宿主抗肿瘤作用的研究:H22肿瘤细胞来源的Exosomes及HS-Exo在雌性BALB/c小鼠左后腿根部皮下接种免疫3次（15只/组）,免疫结束后一周,在小鼠右腋皮下接种亲本细胞H22细胞,5×l05个/只,观察各组肿瘤生长情况;用MTT法检测BALB/c小鼠脾细胞增殖情况和细胞毒活性;用免疫组织化学法检测肿瘤组织中CD4+、CD8+ T淋巴细胞浸润情况; BALB/c小鼠右肋部皮下接种H22细胞（15只/组）,5×l05个/只,肿瘤长至可触及大小后,分别于对侧肋部皮下注射Exosomes及HS-Exo进行治疗（10μg/100μl/只）,观察各组肿瘤大小及其小鼠存活期。结果:1.小鼠肝癌细胞(H22)来源的Exosomes及HS-Exo制备及其免疫相关蛋白的分析:从小鼠肝癌细胞H22培养上清液中提取出Exosomes及HS-Exo,电镜观察两者形态相似,均为大小不一,呈圆形或椭圆形的膜性囊泡,直径约为20～90nm,中央可见为低密度光亮区,常聚集成群。经Bradford法分别定量Exosomes及HS-Exo的总蛋白,显示相同体积H22培养上清液中提取出的Exosomes的平均浓度为（1.13±0.13） mg/ml;HS-Exo的平均浓度为（1.23±0.06） mg/ml。经Western blot分析,热休克处理后小鼠肝癌细胞H22分泌的HS-Exo中表达的热休克蛋白70（HSP70）、热休克同源蛋白70（HSC70）、热休克蛋白60（HSP60）、粘附相关蛋白（ICAM-1）与在Exosomes中的表达相比显著上调（P < 0.05）。2.小鼠肝癌细胞(H22)来源的Exosomes及HS-Exo激发宿主抗肿瘤作用的研究:2.1 H22肿瘤细胞来源的HS-Exo组比Exosomes组更有效的抑制了肿瘤的生长（P<0.05）。Exosomes对照组于肿瘤接种BALB/c小鼠后第14天可观察到肿瘤的生长,而HS-Exo组于第18天才观察到肿瘤的生长。且从各组肿瘤生长的大小情况来看:HS-Exo组小鼠肿瘤生长更为缓慢。Exosomes及HS-Exo组在第22天时肿瘤平均体积分别为4.3346cm3、2.5122cm3。2.2小鼠脾淋巴细胞增殖的检测,显示HS-Exo实验组中脾细胞的增长多于Exosomes对照组（P <0.05）;且HS-Exo对免疫后小鼠脾淋巴细胞增殖具有更强的刺激作用（P <0.05）。2.3小鼠脾细胞细胞毒活性随效靶比的上升而逐渐提高, HS-Exo免疫组在效靶比为12.5∶1、25∶1、50∶1、100∶1时肿瘤细胞杀伤率分别高于Exosomes组,存在显著差异性（P<0.05）。2.4两组肿瘤组织切片标本经免疫组织化学染色法检测, HS-Exo组肿瘤组织中有更多CD4+、CD8+ T淋巴细胞浸润,与Exosomes组相比,有显著性差异（P<0.05）。2.5与Exosomes组相比较,HS-Exo治疗组小鼠的肿瘤生长受到更为显著的抑制（P<0.05）。同时观察到H22来源HS-Exo治疗组小鼠生存期较Exosomes组延长,在肿瘤接种100天时, HS-Exo治疗组小鼠有30%小鼠存活。结论:1.超速分级离心和蔗糖密度梯度离心法成功地提取和纯化了小鼠肝癌细胞(H22)源的Exosomes及HS-Exo,该实验方法具有可行性,为今后的Exosomes研究工作提供了实验基础。2.热休克处理能提高小鼠肝癌细胞(H22)源的Exosomes的产量,为具有抗肿瘤作用的新型高效的肿瘤疫苗的研制提供了新思路。3.经热休克处理后小鼠肝癌细胞(H22)源的HS-Exo中一些重要免疫分子如HSP70、HSC70、HSP60、ICAM-1的表达与未经热休克处理小鼠肝癌细胞(H22)源的Exosomes相比显著上调,而这些免疫分子在抗肿瘤作用方面具有极其重要的意义,这就提示HS-Exo可能比Exosomes具有更强的免疫活性,能更好的发挥抗肿瘤的作用。4.经热休克处理后小鼠肝癌细胞(H22)源的HS-Exo能更好的诱导小鼠抗肝癌作用,抑制肿瘤生长;且对接种亲本细胞的BALB/c小鼠具有更好的免疫保护作用;肿瘤出现时间延迟,肿瘤生长缓慢。5.经热休克处理后小鼠肝癌细胞(H22)源的HS-Exo能更好的激活脾淋巴细胞,促进其生长与增殖,从而有效地激活免疫系统;更能增强小鼠脾淋巴细胞细胞毒活性,有效地诱导特异性的杀伤肿瘤细胞活性;可更好的促进CD4+和CD8+ T细胞活化,诱导局部和系统的抗肿瘤免疫,引发特异性的免疫应答。提示HS-Exo能更为有效的诱导T细胞活化,促进宿主的抗肿瘤细胞免疫应答。6.经热休克处理后小鼠肝癌细胞(H22)源的HS-Exo与正常培养小鼠肝癌细胞(H22)源的Exosomes相比,能够诱导更为显著的肿瘤治疗作用。可见经热休克处理后小鼠肝癌细胞(H22)源的HS-Exo作为一种新型高效的肿瘤疫苗可能具有广阔的临床应用前景。