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日本血吸虫致病的中心环节是肝脏虫卵肉芽肿和继发性肝纤维化,而肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)则是血吸虫病肝纤维化的主要效应细胞。HSCs的激活和增殖在肝纤维化的发生过程中发挥重要的作用。研究表明,HSCs的激活过程复杂,涉及多种细胞因子及信号转导通路。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smad通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase,MAPK)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI-3K)通路、核因子NF-κB通路、Janus激酶/信号转导子和转录激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)通路是与HSCs激活和增殖相关的信号转导通路,近年来研究的较为深入。但这些信号转导通路在日本血吸虫感染宿主致肝纤维化过程中的作用机制有待进一步阐明。课题组前期研究表明,ICOS信号的上调可进一步促进肝脏虫卵肉芽肿的形成和HSCs的活化。本课题研究应用ICOSL-KO小鼠及其野生型C57BL/6J小鼠建立日本血吸虫病实验动物模型,探讨共刺激信号ICOSL/ICOS对日本血吸虫感染小鼠HSCs活化有关信号通路的影响,深入阐明其病理机制,为调节HSCs的活化和控制肝纤维化的发生发展提供新的途径。一、日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞的分离、鉴定和培养目的:日本血吸虫感染小鼠原代HSCs的分离、鉴定和培养,为后续实验奠定基础。方法:通过原位肝脏酶灌注法和密度梯度离心法分离感染前(0W)、感染早期(4W)和感染急性病变期(7W、9W)ICOSL-KO小鼠及C57BL/6J小鼠原代HSCs。应用台盼蓝拒染法鉴定原代HSCs的成活率,根据其在328nm波长紫外激发光下自发蓝绿色荧光特性以及在胞浆中特异性表达神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)鉴定原代HSCs的纯度。结果:新鲜分离的原代HSCs的得率为(1.81±0.2)×106个/鼠,存活率达到90%以上。倒置荧光显微镜于波长328nm的紫外激发光下观察新鲜分离的原代HSCs,能够自发蓝绿色荧光。分离的原代HSCs进行GFAP免疫细胞化学染色,细胞浆中出现红色荧光,其纯度为90%以上。HSCs原代培养过程中,细胞生长情况及状态良好。结论:日本血吸虫感染小鼠后,分离培养的原代HSCs存活率及纯度均达到90%以上,满足后续实验要求。二、日本血吸虫感染小鼠HSCs中促纤维化分子基因表达水平及与活化增殖相关信号通路分子基因的动态表达目的:探讨日本血吸虫感染宿主致肝纤维化的进程中,C57BL/6J小鼠原代HSCs的活化程度以及与活化增殖相关信号通路分子基因的动态表达。方法:应用TRIzol Reagent抽提培养7d原代HSCs的总RNA,采用实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR,Real-time PCR)法检测C57BL/6J小鼠原代HSCs中α-SMA、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、TGF-β1等与其活化增殖相关信号通路分子基因的表达水平,比较各个基因在血吸虫病过程中的动态变化。结果:日本血吸虫感染小鼠,随着病程的进展,原代HSCs中α-SMA、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、TGF-β1、Smad4基因的表达水平逐渐上调。Smad2、Smad3、ERK1、ERK2、PI-3K、AKT、JNK、NF-κB、JAK1、STAT3、STAT5基因的表达水平从感染后4周开始上升,7周达到峰值,9周下降。其中原代HSCs中Smad7在感染后4周的表达水平短暂升高,随后下降。STAT1基因则在感染后呈持续下降趋势。结论:日本血吸虫的慢性致病过程中,HSCs呈持续活化状态。TGF-β1/Smad信号通路是目前研究肝纤维化最为经典的信号通路,在致病过程中发挥关键的作用,ERK、JNK、PI-3K/AKT、NF-κB、JAK/STAT信号通路的相关分子基因除STAT1与日本血吸虫感染导致的肝纤维化的进程呈负相关,其余均呈正相关关系。本研究结果显示,ERK、PI-3K/AKT、JAK/STAT信号通路中相关基因的表达在肝纤维化进程中的变化更为显著,与肝纤维化程度关系更为密切,提示可能通过干预上述相关信号通路来调节肝纤维化的发生发展。三、共刺激信号ICOSL/ICOS对HSCs中促纤维化分子基因表达水平及与活化增殖相关信号通路分子基因的影响目的:探讨共刺激信号ICOSL/ICOS的下调,对日本血吸虫感染ICOSL-KO小鼠和C57BL/6J小鼠原代HSCs的活化程度以及与活化增殖相关信号通路分子基因的影响。方法:应用TRIzol Reagent抽提培养7d原代HSCs的总RNA,采用Real-time PCR法检测ICOSL-KO小鼠及C57BL/6J小鼠原代HSCs中α-SMA、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、TGF-β1等与其活化增殖相关信号通路分子基因的表达水平,分析比较两者的动态变化。结果:1、日本血吸虫感染小鼠,随着病程的进展,原代HSCs中α-SMA、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ基因的表达水平逐渐升高;ICOSL-KO小鼠原代HSCs中α-SMA、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ基因的表达水平显著低于同时期C57BL/6J小鼠的表达水平。2、TGF-β1/Smad信号通路中TGF-β1、Smad4基因的表达水平随周期变化逐渐升高;ICOSL-KO小鼠原代HSCs中TGF-β1、Smad4基因的表达水平显著低于同时期C57BL/6J小鼠的表达水平。而Smad2、Smad3基因的表达水平从感染后4周开始上升,7周达到峰值,9周下降;ICOSL-KO小鼠原代HSCs中Smad2、Smad3基因的表达水平低于同时期C57BL/6J小鼠的表达水平。在血吸虫病的过程中,原代HSCs中Smad7基因仅在感染后4周时表达水平短暂升高,随后呈下降趋势;ICOSL-KO小鼠原代HSCs中Smad7基因的表达水平显著高于同时期C57BL/6J小鼠的表达水平。3、MAPK途径是HSCs中又一个细胞内信号转导通路,MAPK蛋白家族,包括细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinases,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminalkinase,JNK)等。在MAPK信号途径中,ERK1、ERK2、JNK基因的表达水平自感染后4周开始上升,7周达到峰值,9周有所下降,但仍维持在较高的水平;ICOSL-KO小鼠原代HSCs中,ERK1、ERK2、JNK基因的表达水平显著低于同时期C57BL/6J小鼠的表达水平。4、日本血吸虫感染C57BL/6J小鼠原代HSCs中PI-3K信号途径的PI-3K、AKT基因的表达水平在感染后的4周开始上升,7周达到峰值,9周下降,而在ICOSL-KO小鼠原代HSCs中AKT基因的表达水平自感染后一直处于升高的状态;ICOSL-KO小鼠原代HSCs中PI-3K、AKT基因的表达水平显著低于同时期C57BL/6J小鼠的表达水平。5、日本血吸虫感染小鼠后,随着病程的进展,NF-κB途径中NF-κB基因在C57BL/6J小鼠原代HSCs中的表达水平自感染后4周开始上升,7周达到峰值,9周有所下降,但仍维持在较高的水平,而在ICOSL-KO小鼠中,其表达水平虽略有升高,但总体变化趋势不明显;ICOSL-KO小鼠原代HSCs中NF-κB基因的表达水平低于同时期C57BL/6J小鼠的表达水平。6、JAK/STAT信号途径中的JAK1、STAT3、STAT5基因在原代HSCs中的表达水平自感染后4周开始上升,7周达到峰值,9周有所下降,但仍维持在较高的水平,而STAT5基因在ICOSL-KO小鼠中的表达水平一直处于升高的趋势,且在感染后9周显著高于同时期C57BL/6J小鼠。STAT1基因的表达水平在感染后持续下降,ICOSL-KO小鼠原代HSCs中STAT1基因的表达水平低于同时期C57BL/6J小鼠的表达水平,但在感染后9周略高于C57BL/6J小鼠。结论:日本血吸虫感染ICOSL-KO小鼠的疾病模型中,肝纤维化得到一定程度的缓解。共刺激信号ICOSL/ICOS的下调,HSCs的活化程度减轻,与HSCs活化相关信号通路中促纤维化因子随着疾病的进展呈下调趋势,抑纤维化因子表达上调。本结果发现,下调共刺激信号ICOSL/ICOS,PI-3K/AKT及JAK/STAT信号通路中相关基因的表达下调的更为显著,可能是抗纤维化一个潜在的调控靶点。