目的本研究旨在运用生物信息学和亲和层析方法筛选栀子苷的特异结合蛋白,为研究栀子苷与其靶蛋白之间的相互作用和揭示栀子苷的分子作用机制奠定基础,此外也为含有活性羟基的其他中药小分子的药物靶标筛选提供了技术手段。方法本研究主要包括三部分内容：第一部分,采用ChemBio3D Ultra软件绘制栀子苷配体的分子结构,基于3D分子相似性计算的程序SHAFTS进行药效团匹配和体积叠合,以栀子苷为小分子探针,从ChemMapper、 PharmMapper和TarFisDock药物靶点蛋白数据库中,搜寻栀子苷的潜在蛋白靶标。采用AutoDock分子对接模块对栀子苷同受体蛋白作用的精确模型进行研究。通过拉马克遗传算法和半经验自由能评价函数筛选对接结果；第二部分,采用环氧氯丙烷作为活化试剂对琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B进行环氧基修饰,将栀子苷通过化学反应共价连接在环氧活化的琼脂糖凝胶表面,制备以栀子苷为配基的亲和载体,利用高效液相色谱验证其偶联率和偶联量。通过固定有栀子苷的亲和载体,从小鼠脑组织和人外周血单个核细胞中筛选栀子苷的特异结合蛋白；第三部分,通过栀子苷和异硫氰酸荧光素标记的地塞米松共同孵育外周血单个核细胞,用流式细胞仪检测药物摄取情况,初步验证栀子苷与糖皮质激素受体之间是否存在相互作用。结果1.虚拟筛选预测出栀子苷的结合蛋白可能为糖皮质激素受体,通过分子对接模块,结果显示栀子苷与糖皮质激素受体的评分函数Total score为10.56,受体对接进配体的不适合程度为-1.27,极性函数得分为3.59。2.通过对反应条件进行优化,得出环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶的最佳反应条件为：15%体积分数的环氧氯丙烷、0.8 mol/L NaOH于37℃反应3h,环氧基活化密度为122μmol/mL。3.通过化学反应将栀子苷共价偶联在环氧活化的琼脂糖凝胶上,用高效液相色谱检测出栀子苷的偶联率为19.53%,偶联量为17.08μmol/mL。4.运用亲和层析方法,从小鼠脑组织总蛋白和人外周血单个核细胞中筛选出多条蛋白条带,经过质谱鉴定,主要为糖皮质激素受体、热休克蛋白70、热休克蛋白90和谷氨酰胺合成酶等组成。5.流式细胞仪检测发现,与对照组相比,当加入不同浓度栀子苷后,会明显降低外周血单个核细胞中地塞米松的平均荧光强度,影响外周血单个核细胞对地塞米松的药物摄取。结论1.通过基于配体的虚拟筛选预测出糖皮质激素受体可能为栀子苷的结合蛋白,分子对接结果显示栀子苷与糖皮质激素受体对接较好,其结合口袋位于分子内部。2.确立了琼脂糖凝胶环氧活化的最佳反应条件,制备了栀子苷为配基的琼脂糖凝胶亲和载体,成功地从小鼠脑组织和人外周血单个核细胞筛选出栀子苷的特异结合蛋白,包含糖皮质激素受体。3.通过药物摄取实验发现,栀子苷可以与地塞米松竞争性结合糖皮质激素受体,提示栀子苷可能与糖皮质激素受体之间存在相互作用。