血管生长抑制因子kringle 5 (K5)是目前发现的一种能够抑制血管内皮细胞增殖和肿瘤生长的人纤溶酶原片段,特异性高、毒副作用小,在肿瘤的治疗方面具有潜在的应用价值。本实验在前期成功表达融合型血管生长抑制因子K5的基础上,研究表达非融合型K5。根据已经发表的K5基因序列设计对应的PCR引物,通过PCR方法从已有的重组载体pET32a-K5中扩增出K5基因,将K5基因克隆入原核表达载体pET15b,成功构建了pET15b-K5非融合表达载体。重组载体导入到大肠杆菌BL21(DE3)中后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明目标蛋白主要以可溶形式存在于菌体细胞质中。将菌体破碎后取上清进行阳离子交换层析,纯化获得纯度大于95%的目标蛋白,脱盐后对其分子量进行测定,推测目标蛋白形成了三聚体。实验还通过鸡胚绒毛尿囊膜法证明蛋白产物对鸡胚绒毛尿囊膜血管增生有一定的抑制作用。本研究在构建非融合型肿瘤血管生长抑制因子K5原核表达系统的基础上,采用单因子试验,逐一对重组菌的发酵培养基成分进行了优化,并通过测定菌体干重确定了最终优化的合成培养基组成为：胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化钠10 g/L,葡萄糖6 g/L,氯化铵2.6 g/L,磷酸氢二钠6 g/L,磷酸二氢钠5 g/L。在优化培养基上制作生长曲线,确定重组菌体生长的对数期。同样采取单因子实验,分析了诱导剂量、时间、温度、转速这四个因素对菌体生长及目的蛋白表达的影响,通过SDS-PAGE检测确定最佳的发酵条件,确定最终优化条件为：温度37℃,诱导剂量0.01 mmol/L,转速220 rpm,诱导时间6 h,目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白量的20%左右。从而为下一步深入研究这种新的聚集体重组蛋白打下了基础。在对K5基因序列进行分析之后,通过PCR从已有的克隆载体扩增出了一种突变K5序列,这种序列删掉了kringle环两边的氨基酸臂部分对应的基因,将改造过的K5序列克隆入原核表达载体pET25b,成功构建了pET25b-K5非融合表达载体。重组载体导入到大肠杆菌BL21(DE3)中后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明目的蛋白分子量大约在10 KD,与预期的一致。