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1.基因组水平上的二化螟P450基因家族分析二化螟Chilo suppressalis(SSB)是我国及其他东南亚国家最重要的水稻害虫之一。本研究在二化螟基因组与转录组中共发现77个CYP基因,并经RT-PCR验证。采用RACE技术扩增,获得了20个CYP基因的转录本全长,30多个CYP基因的完整开放阅读框(ORF)。二化螟CYP基因可分为四个clan:CYP2,CYP3,CYP4以及线粒体clan。系统进化分析结果表明,CYP3 clan发生了明显的扩增。同时我们也鉴定出二化螟特有的P450亚家族CYP321F,这一亚家族在基因组上串联重复。2.Cs-phantom基因的全长克隆和表达分析克隆了二化螟Cs-phantom(CYP306A1)基因的全长。Cs-phantom开放阅读框共478个氨基酸,包含5个保守的P450 motifs(Helix-C,Helix-I,Helix-K,PERF,heme-binding)。系统进化分析表明Cs-phantom在鳞翅目昆虫中高度保守。定量PCR分析结果表明,Cs-phantom在前胸腺中高表达,且在整个幼虫发育期高表达,在幼虫初期低表达,幼虫第3-4天达到峰值,蜕皮前低表达。3.Spook基因的RNA干扰分析Spook基因属于P450家族,参与蜕皮激素生物合成。分析发现,Cs-spook基因具有多个保守的P450 motifs,如Helix-C,Helix-I,Helix-K和PERF motif(PxxFxPxRF)。定量PCR分析表明,Cs-spook基因在幼虫末期表达量高于初蜕皮幼虫,且在前胸腺中高表达。利用dsRNA干扰Cs-spook基因,采用qRT-PCR检测24h,48h及72h后Cs-spook基因的表达变化,结果显示注射dsRNA 24小时后,Cs-spook的表达量降至9%,48小时后降至33%,72小时降至24%。同时检测了蜕皮激素滴度的变化,结果显示干扰Cs-spook后,二化螟蜕皮激素滴度显著下降,并导致二化螟幼虫发育迟缓。dsRNA处理组中的发育迟缓通过20-E处理可获得恢复,表明Cs-spook参与20-E的生物合成,调控二化螟的蜕皮。4.miRNA参与调控20-E的生物合成miRNA是一类内源性小RNA分子,在转录后调控基因的表达。为研究miRNA对蜕皮激素合成的调控作用,采用4个靶标预测软件进行预测,共发现七个miRNA(Bantam,miR-8,miR-080,miR-089,miR-124,miR-154 and miR-257)作用于蜕皮激素合成通路。通过双荧光素酶报告基因载体实验验证了Bantam,miR-080,miR-089,miR-154和miR-257对Cs-spook基因的调控作用。共转染5个miRNA的类似物,发现包含Cs-spook 3’UTR的靶标基因荧光含量分别下降了大约36%,19%,14%,45%和57%。结果表明,至少5个miRNA对Cs-spook基因具有调控作用。检测了miR-257在不同发育时期的表达量,结果表明miR-257与Cs-spook表达呈负相关。综合细胞水平验证、miR-257及Cs-spook的表达变化结果,证明miR-257通过调控Cs-spook,参与二化螟20-E的生物合成,进而调控二化螟的蜕皮。