机体长期营养过剩会引起体内的脂肪细胞过度分化和大量积累从而引发肥胖症。研究显示肥胖能够增加二型糖尿病、心血管疾病的患病风险,成为糖尿病、高血压的高危因素。值得注意的是,随着年龄的逐渐增加肥胖症的发生也呈上升的趋势。生长激素(Growth hormone, GH)由腺垂体前叶分泌,在个体发育过程中逐渐升高,成年时至高峰,之后分泌量随着年龄的增加而降低。临床研究表明,人体内GH的状况与肥胖之间有着一定的关联,GH能够在一定水平上调节脂肪组织的代谢活动,降低内脏脂肪量并改善心脏健康状况,但具体机制并不清楚。在转基因小鼠的研究中,人们发现生长激素受体(GHR)缺失了STAT5B (Singal transducer and activator of transcription 5B)的活化位点则引发小鼠肥胖。本实验室前期的研究结果表明,GH的STAT5B通路能够降低脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase, Fasn)的表达,从而发挥减缓脂肪成熟的作用,这都说明STAT5B在GH对肥胖的调节中可能起到重要的作用,阐明其作用机制能够为预防和治疗肥胖症提供较好的理论依据。本课题的工作分以下二部分开展：第一部分 生长激素对脂肪细胞分化及脂肪组织的影响研究目的：探讨生长激素对3T3-L1前脂细胞分化过程中基因表达的影响以及生长激素对高脂喂养的C57BL/6小鼠内脏脂肪组织中基因表达的影响。研究内容：1.应用3T3-L1前脂肪细胞作为模型,诱导脂肪细胞分化。同时在分化过程中加入生长激素(125ng/ml)进行干预,在分化的第0,2,3,4,5天收取细胞。检测脂肪代谢相关的分子如Fasn表达变化以及激素敏感性脂肪酶(Hormone-sensitive lipase, HSL)的活性变化。2.构建包装靶向抑制STAT5B表达的shRNA’慢病毒：]LV3-STAT5B-shRNA,感染3T3-L1前脂细胞后筛选出STAT5B敲出的细胞克隆。以表达LV3-NC的慢病毒为阴性对照,分别诱导两种脂肪细胞分化,分别在分化的第0,2,3,4,5,10天收取细胞。qPCR, Western blot检测脂肪分化相关的分子如过氧化物酶体增殖物活化受体(Peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ)以及与脂质代谢相关的p-HSL表达变化。3.分别用普通饲料和高脂饲料喂养6周龄C57BL/6小鼠,在高脂喂养的小鼠中随机选取部分进行生长激素腹腔注射,其余两组注射灭菌的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline, PBS)。继续饲养12周后麻醉、处死小鼠,检测血糖等生化指标。同时检测生长激素对小鼠内脏脂肪基因表达的影响。4.观察GH在PKA抑制剂(H89)作用下对激素敏感性脂肪酶(Hormone-sensitive lipase, HSL)活性的影响。分四组诱导3T3-L1细胞分化：依次加入诱导剂,诱导剂+GH,诱导剂+H89,诱导剂+GH+H89。作用2天后检测cAMP反应元件结合蛋白 (cAMP responsive element-binding protein, CREB), HSL的磷酸化水平。研究结果：1.经过诱导,两组细胞均能进行分化,但是油红O染色显示,在分化第五天时GH处理组细胞与对照组相比分化效率明显降低。对不同天数收取的两组细胞样品进行Western blot分析发现,与对照组相比,GH处理组细胞在分化过程中STAT5B基因一直处于活化状态,与脂肪积累相关的蛋白如Fasn表达降低,与脂肪分解相关的p-HSL蛋白水平升高。2.经过加入嘌呤霉素进行筛选后,Western blot检测证明,敲出STAT5B蛋白表达与对照组相比降低到10%,基因表达干扰效果较好。分别对两组细胞进行诱导分化后,油红O染色显示,在分化成熟后STAT5B敲出的细胞分化效率明显高于对照组。对不同天数收取的两组细胞样品进行Western blot分析发现,与对照组相比,STAT5B敲出的细胞在分化过程中STAT5B基因也处于受抑制状态表达降低,与脂肪积累相关的蛋白如Fasn表达与对照相比出现差异,其中Fasn表达呈逐渐升高趋,在第5天相比于对照组升高,与脂肪分解相关的p-HSL蛋白表达水平降低。经过qPCR检测,在分化至第10天时,STAT5B敲出的脂肪细胞中PPARγ, C/EBPα等mRNA水平与对照组相比表达均升高。3.经过12周的造模,高脂喂养组体重增长超过本身的20%,成为肥胖模型组；而腹腔注射GH的高脂饮食组体重变化介于正常对照组和高脂喂养组之间,体重增长没有达到肥胖模型要求,其每日食物摄取和体质百分数均低于其他两组。血糖浓度显示GH注射组空腹血糖浓度接近于高脂喂养组,口服葡萄糖耐受实验(OGTT)实验表明GH注射组的糖耐量优于高脂喂养组,更接近于正常对照组(两小时后血糖为,正常对照组：8.6 mmol/L, GH注射组：10.4 mmol/L,高脂喂养组：14.6 mmol/L)。从生化指标检测来看,GH注射组与高脂喂养组相比能够降低动物血清中的甘油三酯(Triglycerides, TG)和胆固醇(Cholesterol, CHO)的含量。对内脏脂肪组织进行Western blot分析发现在GH注射组中p-HSL蛋白表达明显高于高脂喂养组,但是低于正常对照组。4.月旨肪分化诱导剂本身就能够活化HSL,同时在蛋白激酶A(PKA)抑制剂(H89)的作用下p-HSL水平明显降低,而且PKA活性的分子标记p-CREB的水平也降低。生长激素+诱导剂+H89的细胞中相比于诱导剂+H89组p-HSL和p-CREB水平升高。研究结论：1.在细胞模型和实验动物模型中,生长激素作用能减缓脂肪细胞的分化或缓解高脂喂养引发的脂质积累。2.敲出STAT5B后,分化过程中Fasn和p-HSL变化与生长激素作用时相反,提示生长激素可能通过STAT5B分子发挥对脂肪细胞分化的调节作用。3.在高脂喂养的动物模型中,GH通过调节Fasn和p-HSL的水平来影响内脏脂肪细胞组织。4.生长激素能够通过PKA来影响p-HSL的水平。第二部分生长激素信号通路中STAT5B影响脂肪细胞分化的机制研究研究目的：探讨STAT5B在脂肪细胞分化过程中的作用机制研究内容：1.诱导3T3-L1细胞分化,以油红O染色观察脂肪细胞的分化程度。收取蛋白样品检测前脂细胞和成熟的脂肪细胞之间STAT5B等基因表达的差别。2.诱导3T3-L1细胞分化,以油红O染色观察脂肪细胞的分化程度。分别在第0,2,4,6,8,10天收取蛋白样品,检测STAT5B,MOF等基因在脂肪分化过程中的变化趋势。3.提取第一部分中所叙述的正常小鼠和高脂喂养小鼠中的内脏脂肪组织进行Western blot分析,检测在动物内脏脂肪组织中STAT5B和MOF的表达情况。4.在STAT5B敲出的前脂细胞中检测MOF的表达情况。5.双荧光素酶实验检测STAT5B对MOF转录活性的影响,检索数据库,查找小鼠MOF基因的启动子序列,利用基因工程的方法构建过表达STAT5B的载体以及多种MOF启动子(全长启动子和部分启动子片段)的报告基因,同时在MOF启动子上对已经报道的STAT5B结合位点(GAS序列)进行突变,检测荧光素酶活性。测定STAT5B在细胞内能否促进MOF启动子的转录活性。应用染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)的方法检测在3T3-L1脂肪细胞内STAT5B是否跟MOF启动子上的相关序列有物理的结合。6.构建包装靶向抑制MOF基因表达的shRNA;慢病毒：LV3-MOF-shRNA,感染3T3-L1前脂肪细胞后筛选出稳定低表达MOF的细胞克隆。以表达LV3-NC的慢病毒为阴性对照,分别诱导两种脂肪细胞分化,在分化的第0,10天收取细胞。以qPCR, Western blot检测MOF表达敲出的细胞中脂肪分化相关的分子如(PPARγ, Fasn, Fabp4,等)表达情况。7.构建带有FLAG标签的过表达MOF的载体,以及带有CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein α, C/EBPα)和PPARγ启动子序列的报告基因载体,利用双荧光素酶实验检测过表达MOF是否能够抑制C/EBPα或PPARγ启动子的转录活性。将C/EBPα启动子分为多个片段,寻找MOF影响转录活性的区域。研究结果：1. 分化成熟的脂肪细胞与3T3-L1前脂细胞相比STAT5B, MOF, H4K16ac等蛋白表达的水平均升高,其中MOF的mRNA表达水平也升高。2. 油红O显示在分化的第0,2,4,6,8,10天,随着时间推移,脂肪细胞的数量逐渐的增多。Wesrten blot检测结果显示随着脂肪细胞的分化,MOF蛋白的表达伴随着STAT5B蛋白水平的增加而增加。但是H4K16ac水平并没有随着MOF蛋白的增加而升高。3.肥胖小鼠与正常对照小鼠相比STAT5B和MOF的蛋白水平都有显著的增加,说明在动物体内与体外培养的细胞模型中STAT5B和MOF表达的趋势相一致。4.慢病毒表达的shRNA可使3T3-L1前脂细胞中的STAT5B表达降低至对照的30%,同时MOF的蛋白水平也降低至对照的40%。5. 荧光素酶实验结果显示,在HeLa细胞中过表达STAT5B蛋白或者GH刺激能够增加MOF全长启动子的转录活性。将全长的启动子中假定的STAT5B结合位点突变之后,GH刺激后启动子失去活性。ChIP实验显示,在分化成熟的脂肪细胞中STAT5B能够结合于MOF启动子上的GAS序列。6.慢病毒表达的shRNA可成功地敲出3T3-L1前脂细胞中MOF的表达,可降低至相应对照的30%；前脂细胞敲出MOF表达后,在诱导分化过程中与脂肪分化相关的基因表达都有所升高,其中包括C/EBPα, PPARγ, Fabp4, Fasn。7在HeLa细胞中过表达MOF对PPARγ的转录活性没有影响,但能够抑制C/EBPα的转录活性,进一步进行启动子截短分析之后发现人为去除启动子-800bp到-200bp的片段后,过表达MOF不能抑制C/EBPα启动子的转录活性。研究结论：1.脂肪分化过程中STAT5B和MOF表达逐渐升高。2.3T3-L1脂肪细胞中STAT5B通过调节MOF的表达,部分的调节脂肪分化。3.3T3-L1前脂细胞中敲出MOF后,在诱导其分化过程中,能够增加多种促分化蛋白的表达。4.MOF能够下调C/EBP α启动子活性。5.STAT5B和MOF对脂肪分化进行反馈调节。