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杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是具有保健功效的药用植物,近年来研究发现,杜仲叶主要成分与杜仲皮相近,且具有等同药理功效,为了进一步分析杜仲叶中具体的功效因子。本文以杜仲叶为研究对象,通过对杜仲叶有效成分不同方法的提取、分离、纯化研究;通过薄层色谱和紫外光谱分析,并经电喷雾源-质谱和核磁共振检测对纯化组分进行结构分析,旨在进一步确定最佳提取分离方法,发现杜仲叶有效成分的分子结构,为杜仲叶的开发利用奠定基础。主要研究结果如下:1.杜仲叶有效成分的提取分别采用回流法、超声波法、微波法对杜仲叶中有效成分进行提取。考察料液比、提取时间、乙醇浓度、溶剂pH值、提取次数等因素对有效成分提取率的影响,经正交试验优化,最终比较得出采用超声波辅助回流提取法较好。最佳提取工艺为:料液比为1:10,提物温度80℃,乙醇浓度30%,提取溶剂pH值为5,先超声波提取30min,然后回流法提取30min ,重复此操作1次。根据最优工艺组合,称取5kg杜仲叶进行扩大试验,最终杜仲叶提取物的出粉率为24%,其中含绿原酸22.29%,含总黄酮54.67%。2.杜仲叶粗提物的分离纯化首先从九种大孔树脂中筛选出最佳的吸附树脂为NKA-Ⅱ,对绿原酸的静态吸附量为17.17mg/g,吸附率为90.92%,解吸率为75.63%,对总黄酮的静态吸附量为49.16mg/g,吸附率为90.44%,解吸率为70.02%;然后通过静态吸附-解吸试验表明,NKA-Ⅱ树脂属于快速平衡型树脂,静态吸附4h后达到吸附饱和,最佳的吸附液pH值为4,用70%乙醇为解吸液可将绿原酸、黄酮类化合物有效的洗脱下来;接着通过动态吸附-洗脱试验结果显示,上样液浓度为绿原酸0.9012mg/mL,总黄酮3.4406mg/mL;上样液流速为1.0mL/min,上样液体积不宜超过10倍的柱体积。根据小试验的优化参数,进行扩大试验。称取600g杜仲叶粗提物,经NKA-Ⅱ大孔树脂分离,依次采用纯净水(18L)、30%乙醇(9L)、50%乙醇(15L)、70%乙醇(12L)、90%乙醇(3L)进行梯度洗脱,得到三个组分依次为FA(64.93g)、FB(36.06g)和FC(30.27g)。其中FA含有大量的绿原酸类物质,FB中既含有绿原酸类物质又含有黄酮类物质,FC主要含黄酮类化合物,故选用FA和FC进行纯化。称取25g的组分FA,采用乙醇-水(0%、10%、20%、30%、40%)梯度洗脱,经聚酰胺柱分离得到三个组分FA-1、FA-2和FA-3,收集第21～70管洗脱液浓缩后,再经Sephadex LH-20树脂纯化得到组分FA-2。称取25g的组分FC,采用乙醇-水(0%、30%、40%、50%、60%、70%、90%)梯度洗脱,经聚酰胺柱分离得到五个组分FC-1、FC-2、FC-3、FC-4和FC-5,将第27～73管、第105～150管、第295～315管洗脱液浓缩冷冻干燥后,再分别经Sephadex LH-20树脂纯化得到组分FC-2、FC-3、FC-4。3.纯化组分的结构鉴定薄层色谱分析表明,在此展开体系下四个组分的斑点清晰而集中,组分FA-2的Rf值为0.265与绿原酸标准品一致,组分FC-2、FC-3、FC-4的Rf值分别为0.632、0.211、0.737,属于黄酮类化合物。紫外光谱分析结果显示,组分FA-2的最大吸收波长为324nm,其紫外吸收特征与绿原酸标准品一致;组分FC-2、FC-3、FC-4具有黄酮类化合物典型的紫外吸收特征峰,其带ⅠUVmax分别为349nm、345nm、367nm,带ⅡUVmax分别为256nm、254nm、254nm,推断组分FC-2和FC-3为黄酮苷类化合物,组分FC-4可能为槲皮素。经电喷雾源-质谱检测和核磁共振检测综合推断,从杜仲叶中分离纯化的四个组分均为单一化合物,化合物FA-2为绿原酸,化合物FC-2为槲皮素-3-O-β-葡萄糖苷,化合物FC-3为槲皮素-3-O-乙酰葡萄糖苷、化合物FC-4为槲皮素。