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链霉菌是一类丝状原核生物,产孢,基因组G+C mol%含量在80%左右。链霉菌广泛存在于土壤,海洋,植物组织内以及空气中。来源于链霉菌的天然活性次级代谢产物中占已知天然活性产物的70%~80%,包括杀虫、除草、抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、酶类等生物活性的物质。本研究以本实验室分离到的链霉菌3-10作为研究对象,对其分类地位、生物活性、抗真菌物质的分离纯化与鉴定、挥发性物质的生防潜力进行系统研究,主要结果如下:1.确定了链霉菌3-10的分类地位。从培养特征、显微形态、生理生化特征和分子鉴定对菌株3-10进行了鉴定。证明该菌株属于阳陵链霉菌(Streptomyces yanglinensis)的一个新的进化型(Phylotype)。2.确定了提取链霉菌3-10抗真菌物质的有机溶剂剂及提取程序。发现乙酸乙酯是最佳的提取有机溶剂。通过菌丝生长抑制法确定了链霉菌3-10粗提物的抑菌谱。结果表明:粗提物浓度为5μg/mL时对供试的16种植物病原真菌的抑制率大于80%。粗提物可以抑制灰葡萄孢的分生孢子萌发,以及根霉和毛霉的孢囊孢子萌发和芽管伸长。在草莓果实贮藏期,粗提物可以抑制灰葡萄孢、核盘菌、根霉、毛霉在果实上的侵染,显著降低草莓腐烂严重程度。在保护地种植的草莓上,施用50μg/mL的粗提物可以降低草莓灰霉病的病情严重程度,田间试验防效在50%左右,试验过程中未发现粗提物对草莓生长有任何不良影响。粗提物对大麦白粉病可以起到保护作用兼具治疗作用。3.明确了链霉菌3-10粗提物抗真菌活性的影响因子。结果表明,80°C处理10 min可以使粗提物的生物活性显著下降。当粗提物经紫外线(UV-C)下照射1 min后其生物活性就开始下降,照射20 min后粗提物的生物活性完全丧失。在酸性条件下粗提物的水溶液呈悬浊液状态,具有较高的生物活性。在碱性条件下粗提物水溶液呈澄清状态,其生物活性有所下降。将粗提物制备成干粉后,粗提物的抗真菌活性在低温至常温条件下能保持较长时间。4.从链霉菌3-10的发酵产物中分离纯化出2个抗真菌化合物,即Reveromycin A和Reveromycin B。这两个化合物均为白色无定形粉末,易溶于甲醇,不溶于水。这两个化合物对4种植物病原真菌都能表现良好的抑菌作用。在相同环境pH值条件下,Reveromycin A的抗真菌活性高于Reveromycin B。在pH=4.5条件下,Reveromycin A对灰葡萄孢、核盘菌、根霉、毛霉菌丝生长的EC50分别为0.88μg/m L、0.65μg/mL、0.67μg/m L和0.73μg/mL;对灰葡萄孢分生孢子萌发的EC50为0.57μg/mL;对根霉、毛霉孢囊孢子萌发EC50分别为0.10μg/mL和0.11μg/m L;Reveromycin B对灰葡萄孢、核盘菌、根霉、毛霉菌丝生长的EC50分别为5.37μg/m L、5.49μg/mL、4.48μg/m L和4.07μg/m L;对灰葡萄孢分生孢子萌发的EC50为4.01μg/mL;对根霉、毛霉孢囊孢子萌发EC50为1.15μg/mL和1.59μg/mL。Reveromycin A和Reveromycin B的抗真菌活性随着环境pH值的升高而下降。5.明确了链霉菌3-10产生的挥发性物质(Volatile organic compounds,VOCs)的化学成分及抗真菌活性。通过GC-MS检测及数据库比对,确定了不同培养时间的链霉菌3-10产生的VOCs种类及含量。共检测到19种VOCs,包括脂肪醇类、芳香族醇类、萜类、有机酸酯类和烯烃类。其中,2-甲基异莰醇是链霉菌3-10产生的VOCs的主要成分。在10 d菌龄培养物中,2-甲基异莰醇的相对含量占27.9%。从中选择了4种VOCs,即2-甲基异莰醇、2-甲基丁酸甲基酯、苯乙醇和石竹烯,测定了这些物质的纯品对黄曲霉和寄生曲霉菌丝生长和产孢抑制活性。结果表明:2-甲基异莰醇、2-甲基丁酸甲基酯和苯乙醇均可以显著抑制黄曲霉和寄生曲霉的菌丝生长和产孢,石竹烯几乎没有抗真菌活性。同时,2-甲基丁酸甲基酯对黄曲霉和寄生曲霉分生孢子萌发表现出较好的抑制作用。6.明确了链霉菌3-10产生的VOCs对花生贮藏期黄曲霉和寄生曲霉污染以及产黄曲霉毒素的抑制效果。当链霉菌3-10小麦粒培养物为17 g/L时,所释放的VOCs熏蒸花生籽粒7 d后,显著抑制黄曲霉和寄生曲霉对花生籽粒的侵染。当熏蒸源浓度上升至86 g/L时,可以基本抑制黄曲霉和寄生曲霉对花生籽粒的侵染,在籽粒中也没有检测到黄曲霉毒素的产生。通过扫描电镜的观察发现,经过链霉菌3-10产生的VOCs熏蒸后,黄曲霉和寄生曲霉菌丝变得畸形,塌陷。经高浓度VOCs熏蒸后,黄曲霉和寄生曲霉分生孢子不能萌发。以上结果表明,链霉菌3-10产生的VOCs具有生防潜力。7.获得了链霉菌3-10全基因组信息。全基因组大小为8.65 Mb,染色体大小为8.59 Mb,质粒大小为55.49 Kb,基因组G+C mol%含量为73.8%。在全基因组中预测到了7051个编码基因。通过antismash在线比对发现了34个次级代谢产物合成基因簇。其中,合成reveromycins的基因簇与Streptomyces reveromyceticus SN-593的相关基因簇相似度为100%。从遗传上证实链霉菌3-10具有合成reveromycins的能力。上述研究结果为开发利用链霉菌3-10防治植物真菌病害奠定了基础。同时,关于链霉菌3-10基因组分析为开展该菌株遗传改良研究提供了信息。