多模式Gjb2基因缺失诱导小鼠听力损伤的机制研究

来源 :华中科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhaochunyang2000
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第一部分时间依赖性Gjb2基因敲除模式诱导小鼠听力损伤的机制研究目的:研究在发育不同阶段敲除耳蜗Connexin26对小鼠听力及耳蜗支持细胞发育的影响。方法:将实验动物分为早期敲除组(P0 KD)、晚期敲除组(P8 KD)和对应的早期对照组(P0 Control)、晚期对照组(P8 Control)。运用Cx26flox/flox小鼠与Rosa26-CreER小鼠杂交,构建TMX诱导敲除Gjb2基因的Cx26flox/flox;Rosa26-CreER小鼠。分别在小鼠Corti隧道开放前(P0-P1)及Corti隧道开放后(P8-P9)连续两日给予小鼠他莫昔芬(Tamoxifen,TMX)皮下注射,Cx26flox/flox;Rosa26-CreER作为敲除组,同窝 Cx26flox/flox小鼠作为对照组。基底膜铺片免疫荧光染色及Western Blot检测Cx26敲除情况;在TMX注射后18天ABR检测听阈;树脂切片检测Corti器形态;扫描电镜检测Corti器空间结构;透射电镜检测Corti器超微结构;免疫荧光染色检测Corti器细胞骨架。结果:在早期敲除组及晚期敲除组中,Cx26表达都被成功下调,其敲除率无明显差异。ABR检测显示,TMX注射后18天,仅在早期敲除组小鼠中出现显著的全频重度听力损失。对树脂切片及基底膜铺片观察及测量显示,仅在早期敲除组小鼠中Corti器出现明显的发育停滞,Corti器高度下降,柱细胞胞核之间距离缩短。扫描电镜显示早期敲除组小鼠Deiter细胞指突发育异常,柱细胞保持幼稚的粗大形态;同时水平切片透射电镜发现该组小鼠外毛细胞间的Neul空隙被发育异常的肥大指突完全填满。透射电镜显示仅在早期敲除组小鼠耳蜗柱细胞中观测到胞体内的微管数量明显减少。基底膜铺片免疫荧光染色发现,早期敲除组小鼠耳蜗柱细胞乙酰化α-tubulin明显下降,微管细胞骨架发育障碍。结论:Connexin26参与耳蜗支持细胞的早期发育,在发育早期敲除内耳Connxin26影响支持细胞微管的形成,导致支持细胞发育停滞从而引起Corti器发育畸形。而在Corti器发育成熟后敲除内耳Connexin26,并不会导致明显的支持细胞发育停滞及Corti器畸形,这提示在成熟耳蜗中发育好的Corti器形态不依赖Connexin26的表达。第二部分剂量依赖性Gjb2基因敲除模式诱导小鼠听力损伤的机制研究目的:研究内耳不同Connexin26敲除程度对小鼠听力及耳蜗支持细胞发育的影响。方法:将实验动物分为低剂量敲除组(Low KD),中剂量敲除组(Middle KD)、高剂量敲除组(High KD)和相应的对照组(Control)。运用Cx26flox/flox小鼠与Rosa26-CreER小鼠杂交,构建TMX诱导敲除Gjb2基因的Cx26flox/flox;Rosa26-CreER小鼠。在小鼠出生后第0天和第1天(P0-P1)连续两天给予小鼠他莫昔芬(Tamoxifen,TMX)皮下注射,注射剂量在各组分别为0.6mg/10g体重(Low KD)、1.1mg/10g体重(Middle KD)和1.6mg/10g体重,Cx26flox/flox;Rosa26-CreER作为敲除组,同窝Cx26flox/flox小鼠作为相应对照组。冰冻切片免疫荧光染色及Western Blot检测Cx26在各组的敲除情况;基底膜铺片免疫荧光染色检测Cx26在基底膜的敲除模式;P20及P60行ABR检测各组小鼠听阈;树脂切片检测Corti器形态变化及螺旋神经节密度;透射电镜检测柱细胞超微结构;基底膜铺片毛细胞计数明确不同组小鼠毛细胞损伤情况;CtBP2免疫染色、DPOAE、透射电镜评估毛细胞功能。结果:在各敲除组中,Cx26表达都成功下调,Cx26表达量与TMX注射剂量负相关。Cx26阴性支持细胞计数发现,在高剂量敲除组中支持细胞Cx26几乎被完全敲除;在中剂量敲除组中少数支持细胞仍可观察到Cx26信号,而在低剂量敲除组中,表达Cx26的支持细胞较中剂量敲除组更多。ABR检测显示,P20时高剂量敲除组表现为重度的全频听力损失,中剂量敲除组低频有轻度的听力损失,而低剂量敲除组无明显听力损失;P60时,中、高剂量敲除组听力损失加重,低剂量敲除组听阈也可见轻度上移,但无统计学差异。对Corti器形态进行检测发现,高剂量敲除组Corti器发育畸形,中剂量敲除组Corti器形态大体正常,但是高度降低,而低剂量敲除组未见明显改变。螺旋神经节计数显示各组小鼠SGN在P20时无明显变化。对柱细胞超微结构观察发现仅高剂量敲除组中微管密度明显下降,中剂量敲除组中微管密度未见明显改变,但是柱细胞长度及柱细胞胞核间距离都缩短。毛细胞计数显示,P20时仅在高剂量敲除组中出现明显的毛细胞死亡,毛细胞死亡以中回为主;P60时,低、中剂量敲除组底回也出现了外毛细胞的死亡,中剂量敲除组中死亡数量较多。对毛细胞功能进行评估,未发现明显改变。结论:以上结果提示,在Connexin26敲除小鼠模型中,听力损失程度与Connexin26缺失程度正相关。少量支持细胞缺乏Connexin26表达并不会影响支持细胞的发育及听力。在中剂量敲除组中,仅有支持细胞的轻度发育异常,而毛细胞未发生明显死亡及功能改变时,出现听力损失,提示支持细胞发育停滞可能是导致GJB2缺失突变相关耳聋的原因。第三部分空间特异性Gjb2基因敲除模式诱导小鼠听力损伤的机制研究目的:研究空间特异性Connexin26敲除对小鼠听力及支持细胞发育的影响。方法:通过将Lgr5-CreER小鼠及Atoh1-Cre小鼠杂交分别与Cx26flox/flox小鼠及tdTomato报道小鼠杂交,分别构建在部分支持细胞特异性敲除Cx26的Cx26f lox/flox;Lgr5-CreER小鼠及在毛细胞特异性敲除Cx26的Cx26flox/flox;Atoh1-Cre小鼠,检测相应Cre重组酶激活区域的转基因报道小鼠。通过ABR检测各空间特异性Cx26敲除小鼠的听阈。透射电镜及扫描电镜检测各空间特异性Cx26敲除小鼠Corti器发育情况及超微结构。基底膜铺片毛细胞计数检测各空间特异性Cx26敲除小鼠的毛细胞损伤模式。结果:通过在特异性表达的启动子后接入Cre重组酶,并与Cx26flox/flox小鼠杂交,我们构建了2种不同空间敲除模式的Cx26敲除小鼠模型。Cx26flox/flox;Lgr5-CreER小鼠在内指细胞、内柱细胞及第三排Deiter细胞特异性敲除Cx26,而Cx26flox/flox;Atoh1-Cre则在毛细胞区域特异性敲除Cx26。Lgr5-CreER介导的部分支持细胞特异性敲除Cx26小鼠中,一段时间内并未检测到明显的听力改变,形态学检测显示其Corti隧道仍能开放,但扫描电镜发现第三排Deiter细胞指突可见一定增粗畸形且胞体表面不规则,透射电镜未见明显异常,毛细胞计数发现底回第三排外毛细胞出现死亡。而在毛细胞特异性敲除组中,听力、Corti器形态及毛细胞都未见明显改变。结论:单独敲除内指细胞、内柱细胞及第三排Deiter细胞,未明显影响相应支持细胞的发育及Corti器形态,提示支持细胞的发育不仅依赖其本身的Cx26表达;在敲除第三排Deiter细胞Cx26后,观察到底回基底膜的第三排外毛细胞死亡,提示支持细胞的Cx26可能起到维持相应毛细胞存活的作用。而在毛细胞敲除Cx26未观察到明显的耳蜗形态变化及听力损失,提示即使前期研究在毛细胞中检测到Cx26的mRNA表达,然而Cx26蛋白在毛细胞中并不表达或对毛细胞的存活及听力不起重要作用。
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