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肝癌是发病率与致死率较高的实体肿瘤之一,其五年生存率仅有5%-7%且复发率高达60-70%。驱动肝癌的发生发展的因素包括内在因素和外在因素。内在因素指肝实质细胞中发生的突变;而外在因素指肿瘤细胞与周围的基质细胞、免疫系统及非细胞成分的相互作用。对于已经发生突变形成的肿瘤细胞,通过免疫系统或细胞外基质的作用将其清除,从而抑制肿瘤的发展和转移。因此,肿瘤与其外在的环境共同构成肿瘤微环境的相互作用在肿瘤发展、复发及转移中扮演中重要角色。其中,肿瘤浸润免疫细胞及其分泌的细胞因子组成的免疫微环境是影响肿瘤微环境的重要组成部分。由于技术受限,先前对肝癌中复杂的免疫微环境的研究工作大多数是基于大量细胞的水平在原位或经细胞分选后对特定一类细胞进行研究。单细胞测序技术的发展为肿瘤微环境的系统研究提供了有力工具。越来越多的研究表明,免疫微环境中各种免疫细胞以及不同免疫细胞之间的相互作用都影响肿瘤发生和发展,特别在肿瘤的逃逸中也扮演越来越重要的角色。然而目前对于肝癌免疫微环境在单细胞水平的研究,对淋巴细胞类型组成和功能有了初步认识,但肝癌中髓系细胞亚型的特征与肿瘤的作用仍然知之甚少。此外,原发性与复发性肝癌中的免疫微环境之间的异同也尚未知晓。基于肝癌免疫微环境的研究现状,本研究利用单细胞RNA测序和分析技术对6例原发和12例复发肝癌的免疫微环境中免疫细胞组成及其基因表达特征进行鉴定。特别对于髓系细胞,鉴定与肝癌临床表型相关和对肝癌发生发展起到关键作用的细胞亚群。结合免疫组化技术并与公开数据来源的外周血和肿瘤的髓系细胞进行比较分析对鉴定的髓系细胞的组成及功能进行验证。获得以下结果:(1)本研究通过测序并经质控后共获得12,870个CD45~+免疫细胞,鉴定了共14个细胞亚型及其特征基因。包括淋巴系的T淋巴细胞、自然杀伤细胞(natural killer,NK)和B淋巴细胞以及髓系的巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAM)、单核细胞和树突状细胞(dendritic cell,DC)等。进一步对髓系细胞进行细胞亚型鉴定获得7个髓系细胞类型及其特征基因。包括TAM,两类单核细胞亚型FCN1＿mono和Mono4以及三个DC亚型DC1、DC2和DC3等。(2)在癌旁组织中有较多CD4~+初始/CD8~+细胞毒性T细胞和CD160~+NK细胞富集,呈现出激活的免疫微环境。而在肿瘤组织中,与免疫调节作用相关的巨噬细胞、调节性T细胞与CD8~+耗竭T细胞浸润程度较癌旁高。表明在肿瘤组织中的免疫微环境处于一个免疫抑制且不激活的状态。其中,髓系亚型Mono4在肿瘤组织中富集。对原发与复发性肝癌的细胞组成比较发现,仅DC在复发肝癌中相对较高,特别是DC2亚型,而其他细胞组成在原发与复发肝癌中没有显著差异。表明在复发与原发肝癌中,免疫细胞组成相对较一致。(3)对肝癌微环境与健康人外周血中的DC亚型进行了比较。结果表明,DC1与DC2均存在于外周血与肝癌微环境中,而本研究鉴定的DC3(LAMP3+CCR7+)为肿瘤中新的DC亚型,并在黑色素瘤与头颈癌的公开数据中验证了DC3的存在。肿瘤中的DC细胞具有较高的第二类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex class II,MHC-II)分子表达,且有迁移相关特征。表明在肿瘤中的DC有迁移至肿瘤引流淋巴结或肿瘤中通过MHC-II呈递肿瘤抗原并介导CD4~+T细胞活化的功能。此外,本研究发现肿瘤和癌旁中DC1存在不同的募集途径。(4)通过对肝癌微环境中髓系亚型与临床表型的关联分析发现,TAM与FCN1＿mono的高浸润水平均与肝癌组织中的微血管侵犯和高甲胎蛋白水平显著相关。在较高乙肝抗原水平与肿瘤较大的肝癌组织中TAM的浸润水平显著较高。而DC2的高度浸润与肝癌临床中具有较小的肿瘤相关。(5)对各髓系细胞亚型特征与预后的关联分析发现,TAM趋向于M2型极化并在原发性肝癌中指示其不良预后。而两类单核细胞(FCN1＿mono和Mono4)呈现除两种截然不同的免疫功能:FCN1＿mono表达已报道的骨髓来源的抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSC)特征基因,与复发肝癌的二次复发相关;Mono4高表达细胞杀伤性相关基因并与原发肝癌的良好预后相关。三个DC亚型在原发和复发肝癌中均与其良好预后相关。综上所述,本研究通过单细胞RNA-seq对肝癌中髓系细胞亚型及其功能和肝癌的临床表型预后的关联进行了分析和阐述。揭示了肝癌中特有的免疫微环境,鉴定了与临床表型和预后相关的细胞亚型,为未来肝癌的临床诊疗提供潜在的治疗靶点和预后预测指标。