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背景:吉兰-巴雷综合征(Guillain–Barre′syndrome,GBS)是一种世界性分布的免疫介导的急性炎症性周围神经系统疾病。尽管其发病率比较低(0.001-0.002%)且多数病程具有自限性,仍有少数严重病例可见轴突变性碎裂并呈现较高的致残率(15%)和死亡率(5%)。国内外的研究报道均指出,依据受损神经纤维的类型可将GBS进行亚型分类,包括:急性炎症性脱髓鞘性多发神经根神经病(acute inflammatory demyelinating polyneuropathies,AIDP)、急性运动轴索性神经病(acute motor axonal neuropathy,AMAN)、急性运动感觉轴索性神经病(acute motor-sensory axonal neuropathy,AMSAN)、Miller Fisher综合征(Miller Fisher syndrome,MFS)、急性泛自主神经病(acute panautonomic neuropathy)和急性感觉神经病(acute sensory neuropathy,ASN)等。其中欧洲和北美大约90%的病例为AIDP,亚洲及中南美AMAN和AMSAN两型多见。不同亚型之间免疫学发病机制存在差异。AMAN、AMSAN和MFS发病与神经节苷脂自身抗体产生有关,其中大约95%的MFS患者中抗GQ1b自身抗体阳性,而AIDP则主要表现为CD4+辅助性T细胞诱导巨噬细胞及补体活化进而引起周围神经脱髓鞘反应。大量研究表明不同亚型GBS的发病机制、临床病程、严重程度和结局具有高度各异性。其中,2014年张洪亮研究团队在对中国北方地区GBS亚型临床数据统计分析后指出与神经节苷脂自身抗体相关的GBS亚型具有更严重的临床症状和更差的预后。2015年张刚等人对中国西南地区170例GBS患者疾病严重程度做了回顾性研究并得出结论AMAN亚型预后较AIDP更差。上述研究结果提示我们体液免疫异常表现在某些GBS亚型的发病过程中,可能是多数重症GBS的重要免疫学发病机制。滤泡辅助性T细胞(Follicular helper T cells,Tfh),是定位于淋巴滤泡中的一类CD4和CXCR5双阳性的T淋巴细胞亚群,这群细胞在健康人外周血中占CD4阳性T淋巴细胞百分比为(11.9±0.38)%,目前已知的Tfh细胞记忆性标记物包括CD45RA-/CD45RO+。Tfh细胞的主要功能为辅助B淋巴细胞参与体液免疫。依据表面分子标记物CXCR3和CCR6的不同表达可以将Tfh分成Tfh1(CXCR3+CCR6-)、Tfh2(CXCR3-CCR6-)和Tfh17(CXCR3-CCR6+)三种不同的细胞亚群,据报道这些细胞亚群在B细胞的分化、成熟以及免疫球蛋白类别转换过程中起着各自不同的信息传递作用。国内外大量的实验研究证实Tfh细胞数量变化、分子表达异常及其亚群细胞分布失衡与许多自身免疫病的发生、发展和转归有关。目前,Tfh细胞在GBS发病机制中的研究未见报道。目的:研究外周血记忆性滤泡辅助性T细胞(CD4+CXCR5+CD45RA-)及其亚群Tfh1(CXCR3+CCR6-)、Tfh2(CXCR3-CCR6-)和Tfh17(CXCR3-CCR6+)在GBS两个发病率高的亚型AIDP和AMAN疾病进程中的数量变化、表面分子ICOS/PD-1表达水平、细胞亚群的分布比率。探讨上述细胞的变化在GBS发病早期对机体体液免疫状态的影响和调控途径,为未来发展个性化临床治疗提供理论依据。方法:本研究收入急性期吉兰-巴雷综合征患者36例,其中应用免疫球蛋白治疗后的重症患者7例,以及年龄、性别相匹配的体检人群18例作为对照组。根据2012年修订的国际通用临床神经电生理学诊断标准将36名急性期GBS患者进行AIDP/AMAN亚型分组,同时参照休斯功能分级量表(HFGS)和医学研究理事会(MRC)评分标准对全部患者的疾病严重程度进行评估。应用淋巴细胞提取技术和流式细胞技术检测急性期(acute phase)GBS患者及应用免疫球蛋白治疗后平台期(plateau phases)患者、对照组(Control subjects,CS)外周血中Tfh细胞表面标记物CD4/CXCR5/CD45RA/CCR6/CXCR3/ICOS/PD-1以及B细胞表面标记物CD19/CD27/CD38/CD20的表达水平。流式分选获得健康人和AMAN患者外周血B细胞、记忆性Tfh2细胞和Tfh17细胞,并通过体外共培养系统验证患者记忆性Tfh亚群细胞辅助B细胞分化及抗体分泌的功能变化。酶联免疫吸附试验(ELISA)用于检测外周血、脑脊液和细胞共培养上清液中细胞因子IL-21的表达水平,流式微球阵列(CBA)用于检测细胞因子IL-17A,IFN-γ,TNF,IL-10,IL-6,IL-4和IL-2的表达水平以及免疫球蛋白Ig G/Ig A/Ig M的含量,散射比浊法检测脑脊液免疫球蛋白和总蛋白的含量。结果:1.GBS分组包括:24名AMAN和12名AIDP,其中HFGS评分≥4的7名重症GBS全部来源于AMAN组。2.AMAN组患者外周血中CD4+CXCR5+CD45RA-Tfh细胞频数以及Tfh1(CXCR3+CCR6-),Tfh2(CXCR3-CCR6-)和Tfh17(CXCR3-CCR6+)亚群细胞频数均比正常对照组显著升高。而总Tfh及其亚群细胞频数在AIDP组和正常对照组之间差异无显著性。3.AMAN组患者外周血中记忆性Tfh2和Tfh17亚群细胞比率较正常对照组和AIDP组均有不同程度的升高,且(Tfh2+Tfh17)/Tfh1比率变化与疾病严重程度和外周血浆细胞数量正相关。4.AMAN患者外周血记忆性Tfh2和Tfh17亚群细胞表面诱导性协同刺激分子(ICOS)的表达水平较正常对照组和AIDP组升高,相反地,其表面免疫抑制性受体程序性死亡分子1(PD1)的表达水平较正常对照组下降。5.在体外共培养实验中,经过6天的共培养,实验组的活性B细胞(CD3-CD4-)及浆细胞(CD38+CD20-)比例较对照组升高,且培养上清中免疫球蛋白Ig M和Ig G浓度同比升高。6.给予大剂量免疫球蛋白冲击治疗,每公斤体重每天用量0.4g连续5天,且病程进入平台期(发病两周以上)后重症GBS患者外周血中CD4+CXCR5+CD45RA-Tfh细胞总数降低,其中以Tfh17数量下降最为显著,其次是Tfh1,而Tfh2频数变化不明显。同时,亚群分布比率(Tfh2+Tfh17)/Tfh1下降,伴有血清细胞因子IL-21浓度降低。7.免疫球蛋白治疗后重症GBS患者外周血ICOS+Tfh1细胞比例下降;ICOS+Tfh2细胞和PD1+Tfh2细胞比例均下降。8.免疫球蛋白治疗前后重症GBS患者外周血浆细胞(CD3-CD4-CD38+CD20-)比例变化不明显。结论:1.本实验阐释了循环记忆性滤泡辅助性T细胞不同细胞亚群数量变化、细胞表面分子异常表达及其亚群细胞分布失衡在GBS病程中的临床意义,提示AMAN患者体内过度活化的体液免疫应答可能与循环记忆性Tfh亚群细胞数量变化和功能异常有关。2.体外共培养实验结果验证了AMAN患者外周血记忆性Tfh2和Tfh17亚群细胞与正常对照组相比具有更强的协同诱导B细胞分化和抗体分泌的能力。3.重症GBS患者应用免疫球蛋白(IVIg)治疗后外周血中浆细胞比例未见明显下降可能与记忆性Tfh2和Tfh17亚群细胞异常活化状态未被显著抑制有关。寻找有效抑制记忆性Tfh2和Tfh17亚群细胞的方法,进而有效调控病理状态下过度活化的Tfh-B细胞轴,或可成为未来重症AMAN的新型治疗手段。