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目的筛选神经干细胞内与弓形虫ROP18相互作用的蛋白,为ROP18致病的分子机制研究奠定基础。方法第一部分GST Pull-Down筛选C17.2神经干细胞内与弓形虫ROP18的互作蛋白:(1)运用RT-PCR扩增ROP18基因;运用Optigene TM密码子优化分析平台对弓形虫ROP18编码基因进行优化,合成优化后的全长基因(ROP18u);以优化后的ROP18u基因为模板,PCR扩增去除N端信号肽和前功能区序列的截短ROP18片段(ROP18uc),将此3种基因分别克隆入pGEX-6P-1质粒,构建原核表达载体,所有重组质粒均经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,分别转化大肠埃希菌BL21(DE3)诱导表达,Western Blot鉴定重组蛋白,选取可溶性表达最高的菌种。(2)2%N2的DMEM/F12培养液诱导C17.2分化,收集细胞并提取总蛋白。(3)诱导表达ROP18u-GST蛋白和GST标签蛋白,利用体外Pull Down技术分别作用于分化C17.2总蛋白,通过对比获得可能与ROP18u存在相互作用的蛋白,并进行质谱分析。第二部分免疫共沉淀技术筛选c17.2神经干细胞内与弓形虫rop18的互作蛋白:(1)rt-pcr扩增rop18基因,并无缝克隆至慢病毒载体pcdh-cmv-gfp中,经pcr、酶切和测序鉴定正确后,与辅助质粒pmlg/prre、prsv-rev和pmd2.g共转染293t细胞包装pcdh-cmv-gfp-rop18慢病毒,同时包装pcdh-cmv-gfp空载体慢病毒作为对照组。(2)pcdh-cmv-gfp-rop18慢病毒和pcdh-cmv-gfp空载慢病毒分别感染c17.2,加以2%n2的dmem/f12诱导其分化,待绿色荧光大量表达时收集细胞并分别提取总蛋白。(3)合成两段rop18抗原决定簇多肽,分别免疫新西兰兔制备两种兔抗rop18多克隆抗体,并进行elisa和westernblot鉴定。(4)利用rop18多克隆抗体,分别同两种慢病毒感染的分化c17.2总蛋白进行免疫共沉淀,以期通过对比获得在c17.2分化过程中可能与rop18相互作用的蛋白,与gstpull-down的结果相呼应。结果第一部分:(1)经诱导表达后对比发现,优化后的rop18u-gst可溶性蛋白表达量相较于rop18-gst明显上升,经优化剪切后表达的rop18uc-gst蛋白可溶性表达量无显著提升。(2)c17.2经分化后,显微镜下可见胞体上出现明显的形态、数量和长短各不相同的突起,呈树枝分支状。(3)gst标签蛋白pulldownc17.2分化总蛋白前后所得样本经sds-page检测无明显差异;rop18u-gst蛋白与c17.2总蛋白pulldown后的样本相较于pulldown前,sds-page胶多出明显蛋白条带,经质谱分析获得多个可能与rop18存在相互作用的鼠源性蛋白。第二部分:(1)重组慢病毒质粒pcdh-cmv-gfp-rop18经测序鉴定无误,与辅助质粒共转染293t细胞,细胞出现明显cpe且荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光,包装后第2天收获并浓缩pcdh-cmv-gfp-rop18慢病毒;同样方法包装空载pCDH-CMV-GFP慢病毒。(2)两种ROP18多克隆抗体,经ELISA检测,效价分别达到1:64000和1:16000;经Western Blot鉴定,能够特异性识别ROP18重组蛋白。(3)两组慢病毒感染的C17.2均出现不同程度的CPE,荧光显微镜下发现明显绿色荧光。(4)ROP18多克隆抗体未能拉下ROP18蛋白,经Western Blot检测,大部分ROP18蛋白仍残留于免疫共沉淀后的上清中。结论(1)密码子优化未能显著提高ROP18重组蛋白的表达量,但提高了可溶性蛋白的含量。(2)GST Pull-Down联合质谱结果表明ROP18与C17.2神经干细胞内的细胞骨架蛋白、组蛋白等多种蛋白间可能存在相互作用。(3)成功包装ROP18慢病毒感染C17.2神经干细胞,引起细胞病变,并稳定表达ROP18。(4)成功制备两种ROP18多克隆抗体,能够特异性识别ROP18重组蛋白,但不适用于免疫共沉淀实验。