木霉属真菌在生物降解和生物防治方面有巨大的应用潜力,而其中棘孢木霉(Trichoderma asperellum)因生长迅速、抗生能力强、对农作物的生长有更全面地辅助作用等优点而被广泛应用于生物防治和降解方面。然而木霉菌的代谢产物产量较低,特异性强,抗生产物的调控机制研究不深等问题限制了木霉的应用,基于这种情况,本论文的主要目的是为了确定棘孢木霉T4的主要抗生蛋白之一,内切几丁质酶ech42基因的调控因子与几丁质酶诱导物质的转入方式,并采用基因工程和发酵工程的方法,提高棘孢木霉T4包括ech42蛋白在内的的几丁质酶产量,从而强化棘孢木霉抵抗病虫害的能力,进一步挖掘其作为生物防治菌的价值。在确定棘孢木霉T4(Trichoderma asperellum T4)有降解几丁质的能力之后,通过PCR获得ech42启动子区序列,用生物素Biotin对其进行标记之后将其与几丁质为唯一碳源的条件下生长的木霉T4的总蛋白反应获得特异性结合的蛋白;将这些蛋白收集并质谱测序后确定调控子蛋白为cdk5/pho85。利用RNA干扰和过表达的方法改变cdk5/pho85的基因表达量之后,结果显示相比较于野生型,cdk5/pho85的基因表达量分别减少与增多为原本的30%与180%时,ech42的基因表达量同时减少与增多为38%和170%、蛋白表达量减少与增加至20%与180%。结果表明cdk5/pho85的确在一定程度上可以调控Ech42蛋白的表达,从而证明cdk5/pho85是ech42基因的调控子之一。确定木霉ABC蛋白为ABC转运蛋白家族的外排蛋白基因(Exporter)abc-b后,对abc-b进行RNA干扰和过表达并检测了ech42基因表达量的变化,结果显示相比较于野生型,abc-b的基因表达量减少和增多为原本的23%和161%时,ech42基因和表达量分别变为12%和230%、蛋白表达量变为0%和400%。当abc-b基因表达量显著减少的时候,棘孢木霉T4在几丁质、蔗糖、麦芽糖、纤维素分别为唯一碳源的培养基内无法正常生长,只有在葡萄糖为碳源的情况下才能正常生长且菌体几乎完全丧失了转运几丁二糖进入菌体的能力;而在abc-b表达量增多的情况下,菌体在除葡萄糖以外的碳源情况下生长情况均超过野生型对照,菌体转运几丁二糖的速度也高于野生型对照。在几丁二糖为唯一碳源的情况下,abc-b干扰株几乎没有几丁质酶酶活可以被检测到;而过表达株的酶活则高于野生型对照。以上结果表明,abc-b蛋白在棘孢木霉T4中有转运几丁寡糖以及其他种类寡糖进入菌体的功能,而几丁二糖同时也是包括ech42在内多种几丁质酶的诱导物。将cdk5/abc-b双基因过表达之后,从温度、p H、转速和装液量等因素着手,通过单因素优化和响应曲面摸索出cdk5/abc-b工程菌的最佳培养条件,使工程菌株的产酶能力提高为未优化野生型的11倍,显著增加了特定抗生物质的产量,达到了预期目标。本论文确定了棘孢木霉内切几丁质酶42基因的调控基因cdk5/pho85编码的蛋白与几丁质酶诱导物的转入途径ABC蛋白,构建了双基因过表达的高产工程菌,为进一步挖掘棘孢木霉的生物防治潜力、提高生物防治能力提供了重要的理论基础。