背景和目的：金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是医院内感染和社区内感染的重要病原菌之一。尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)是著名的“超级细菌”,可引起菌血症、中毒休克综合症、败血症等多种进行性、坏死性疾病。同时,MRSA的耐药严重,对抗生素呈多药耐药状态,特别是近年来出现万古霉素中介或耐药菌株。因此,监测MRSA的流行和耐药谱已成为全球重要的公共卫生问题。值得关注的是,中国是MRSA流行最严重的国家之一,MRSA与乙肝、艾滋病合称威胁全球的“三大难治感染性疾病”。既往MRSA相关研究主要局限于医院相关性MRSA和社区相关性MRSA。最新研究表明,MRSA的流行模式发生了变化,MRSA可在各种动物食品、动物、动物密切接触者中流行,被称为动物源性MRSA(livestock-associated MRSA, LA-MRSA)。令人担忧的是,LA-MRSA侵入没有动物接触史的健康人群也有报道,甚至侵入医院并引起医院内感染暴发。提示LA-MRSA可能跨越生物种属播散到健康人和医院病人中,将对人类健康和生命造成极大的威胁。LA-MRSA跨越种属导致人感染的传播途径仍未阐明。国外研究主要局限于饲养场中牲畜、饲养员、兽医等人群的MRSA监测研究,我国研究主要局限于各种家畜、宠物MRSA菌株定植情况的零星报道,缺乏对动物密切接触人群MRSA菌株定植和分子特征的详细研究,也缺乏对MRSA菌株定植影响因素的详细报道。而同时研究MRSA在动物从业人员、动物、环境三者中MRSA的分子特征及其相互传播风险,目前国内尚无文献报道。本课题拟对动物饲养场、屠宰场所和乳肉销售场所中动物(主要包括猪、牛、羊、家禽)、动物从业人员、无职业性动物接触史的一般工人(作为对照人群)开展分子流行病学研究,分析动物与人群中MRSA的同源性,明确LA-MRSA通过动物途径跨种属传播给人群的传播途径。本研究可望为揭示LA-MRSA通过动物途径跨种属导致人感染的传播机制开拓新思路,并对控制LA-MRSA在人类的流行和传播具有重要的科学指导意义。方法：采用现况研究方法,调查地点是广东省,调查时间是2013.10-2014.10。本研究采用多阶段抽样方法抽取动物从业人员和对照人群。对动物从业人员和对照人群均进行鼻拭子采样和问卷调查,调查内容包括：基本人口学特征、动物接触史、居住场所动物接触史、过去一年的疾病和用药史、生活习惯、家庭成员有无在医疗卫生系统工作等。对饲养场、屠宰场、肉类零售市场的环境和动物进行棉拭子采样。对生化试验初步鉴定为金葡菌阳性的菌株,进一步采用PCR试验检测16SrRNA和nuc基因,均为阳性者确认为金葡菌；对苯唑西林耐药或mec A基因阳性的金葡菌则确认为MRSA。对分离的金葡菌进行药敏试验测定菌株对抗生素的敏感性,包括：青霉素、苯唑西林、庆大霉素、红霉素、四环素、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因、复方新诺明、克林霉素、氯霉素、利福平、利奈唑胺、万古霉素。药敏实验结果的判读参照CLSI 2012的标准。对三类及三类以上抗生素耐药的菌株称为多重耐药菌株。采用多重PCR的方法对MRSA菌株进行SCCmec基因分型。应用PCR扩增的方法对金葡菌的七个管家基因分别进行扩增,PCR扩增产物经试剂盒纯化后进行测序,测序结果提交网站(http://www.mlst.net/),通过MLST分型数据库进行ST分型。菌株的克隆型别由eBURST version 3 (http://eburst.mlst.net)确定,七个管家基因中有6个相同等位基因视为同一克隆。采用Epidata Version 3.1建立数据库,对调查表的数据进行双人双录入并一致性检验。采用STATA version 13.0 (StataCorp LP, College Station, Texas, USA)软件进行数据分析,样本率的比较用χ2检验或者确切概率法,危险因素分析采用单因素和多因素非条件logistic回归分析。采用非条件logistic回归模型探究动物接触时间(包括每天接触时频率、短期接触时间、长期接触时间)与菌株携带间的动态变化趋势。双侧P≤0.05表示有统计学意义。采用BURST (Based upon related sequence types)算法比较菌株等位基因的进化关系。ST型别间相关性分析,采用非加权配对算数平均数法(UPGMA),根据ST间等位基因错配矩阵构建系统进化树(即UPGMA树状图)。结果：共调查了1178名无职业性动物接触史的对照人群,其MRSA检出率为1.4%(16/1178)。对照人群MRSA主要对p-内酰胺类(100%)、克林霉素(68.8%)、红霉素(62.5%)、四环素(50%)耐药；81.3%对照人群MRSA(13/16)呈多药耐药状态,主要耐药模式是同时对β-内酰胺类、克林霉素、红霉素耐药。对照人群中MRSA的主要型别是ST7(43.8%)、ST59 (12.5%), SCCmec分型结果主要是社区相关的Ⅳ型、V型,且对照人群的109株金葡菌均未检出pv1基因。本研究共调查了682名动物从业人员,MRSA总体检出率为7%(48/682),其中饲养员/兽医检出率为10.7%(26/244)、屠宰/乳肉加工人员检出率为5%(22/438)。动物从业人员MRSA主要对β-内酰胺类(100%)、克林霉素(83.3%)、红霉素(81.3%)、四环素(72.9%)耐药；87.5%MRSA呈多药耐药状态,主要耐药模式是同时对β-内酰胺类、克林霉素、红霉素、四环素耐药。动物从业人员MRSA耐药率和多重耐药状态均比对照人群严重。动物从业人员中检出48株MRSA的主要型别是ST9(33.3%)、ST59 (12.1%)、ST7(10.4%)、ST45 (10.4%);SCCmec分型主要是社区相关的MRSA SCCmec-Ⅳ和SCCmec-Ⅴ;仅有1株MRSA-ST59检出pv1基因。共采集了310头猪,MRSA检出率为2.3%(7/310)。猪源性MRSA对克林霉素、四环素和红霉素的耐药率均为100%。猪源性MRSA均呈多药耐药状,主要耐药模式是同时对β-内酰胺类、克林霉素、红霉素、四环素耐药。猪中检出的7株MRSA菌株主要为ST9(6株)和ST6(1株),SCCmec分型主要是MRSA-Ⅳ,均未检出pv1基因。共采集了299份环境标本,环境中MRSA检出率为4.3%(13/299)。环境中分离了13株MRSA,对β-内酰胺类的耐药率为100%,对四环素和复方新诺明耐药率均为76.9%,对克林霉素、红霉素、氯霉素耐药率均为53.8%；有76.9%环境MRSA呈多药耐药状态,主要耐药模式是同时对p-内酰胺类、克林霉素、红霉素、四环素、复方新诺明耐药。饲养场、屠宰场、乳肉销售场所环境中检出的13株MRSA的ST型别呈多样性,主要是ST7(5株)、ST59(2株)；SCCmec分型主要是MRSA-Ⅳ和MRSA-Ⅴ;均未检出pvl基因。比较人群与动物金葡菌的分子分型发现：动物、从业人员、对照人群中均携带了人群相关的ST59、ST6金葡菌,由此提示ST59、ST6金葡菌可能由人群跨种属导致动物的定植、感染；而ST9金葡菌仅见于动物和从业人员中,对照人群均没有携带这种亚洲广泛流行的动物源性ST9,由此提示动物源性ST9金葡菌可能由动物跨宿主导致人群的定植、感染。值得关注的是,比较人群与动物MRSA的型别发现,本研究的MRSA ST9仅见于从业人员和动物中,对照人群中均没有检出MRSA ST9,且MRSA ST9是亚洲地区广泛流行的动物源性MRSA,提示MRSA ST9可能由动物跨宿主传播给人群,从而导致LA-MRSA在人群的定植、感染。比较人群与环境金葡菌的分子分型发现：环境、从业人员、对照人群中均携带了人群相关的ST7、ST59、ST88、ST1、ST5、ST45、ST2359型别的金葡菌,由此提示此类金葡菌可在环境和人群中交叉感染。值得关注的是,比较人群与环境MRSA的型别发现,ST2359 MRSA(属于CC9)属于亚洲广泛流行的动物源性MRS A,本研究中仅见于环境和从业人员中,对照人群均没有携带这种动物源性MRSA,由此提示这种动物源性ST2359 MRSA可能由动物或环境导致人群的定植、感染；其中人群相关的ST7 MRSA、ST59 MRSA在环境、从业人员、对照人群中均有携带,提示ST7 MRSA、ST59 MRSA可在环境和人群中感染、流行。分析职业性动物接触史与人群MRSA携带关系,结果表明：与无职业性接触者比较,职业性动物接触可提高人群MRSA携带风险(AOR=6.27,95%CI3.42-11.50)。分动物类型也发现,职业性猪和家禽接触均是人群MRSA携带的危险因素(猪：AOR=6.50,95%CI 3.47-12.19;家禽：AOR=4.92,95%CI 1.33-18.27);但职业性其它动物接触可能由于例数较少,对人群MRSA携带的影响无统计学意义。探究职业性动物接触时间与人群MRSA携带的关系,结果表明：每天职业性动物接触频率(小时数)越高,人群MRSA携带率越高(AOR=2.25,95%CI 1.72-2.94)。分动物类型也发现,每天职业性猪接触频率(小时数)越高,人群MRSA携带率越高。探究职业性动物接触年限与人群MRSA携带的关系发现：短期动物接触年数越长,人群MRSA携带率越高(AOR=1.58,95%CI 1.29-1.95);长期动物接触时间与MRSA携带率也存在单调递增趋势(AOR=1.25,95%CI1.16-1.34)。分动物类型分析也发现,短期和长期猪接触年数越长,人群MRSA携带率越高。值得关注的是,以往研究已揭示职业性动物接触与人群MRSA携带存在较强的正相关关系,但职业性动物接触与人群多重耐药金葡菌携带的关系仍未清楚。本研究结果提示：职业性动物接触可明显提高人群多重耐药金葡菌(MDRSA)的携带率(AOR=2.91,95% CI 1.87-4.52),职业性猪接触也可明显提高人群MDRSA的携带率(AOR=2.89,95% CI 1.82-4.58);职业性动物接触可显著提高人群多重耐药MRSA(MDR-MRSA)的携带率(AOR=7.20,95% CI 3.69-14.05),职业性猪接触也可显著提高人群MDR-MRSA的携带率(AOR=7.84,95% CI 3.94-15.61).由此可见,职业性动物接触与人群多重耐药菌株存在较强的正相关关系。每天职业性动物接触频率(小时数)越高,人群MDRSA和MDR-MRSA携带率越高,存在明显单调递增趋势；短期接触年数越长,人群MDR-MRSA携带率越高,存在明显单调递增趋势；长期接触年数与人群MDRSA、MDR-MRSA携带率也存在轻微的递增趋势。既往抗生素使用史、门诊看病史、外科手术史、住院史、皮肤破损／发炎史、家庭成员为医务人员等医院相关因素与人群MRSA携带的关系均无统计学意义。吸烟、饮酒、喝茶、下班回家后立即洗手／洗澡、居住场所饲养牲畜等社区相关因素与人群MRSA携带的关系均无统计学意义。结论：(1)职业性动物接触可提高人群MRSA携带率；每天职业性动物接触频率与人群MRSA携带存在单调递增趋势,短期和长期的职业性动物接触年数与人群MRSA携带也存在递增趋势。因此,职业性动物接触是人群MRSA携带的关键因素。(2)猪中分离的金葡菌和MRSA均呈多重耐药状态,耐药状态不容忽视;人群、环境、猪中MRSA菌株耐药模式保持一致,主要耐药模式均为对β-内酰胺类、克林霉素、红霉素、四环素同时耐药。(3)本研究的MRSA ST9仅见于从业人员和动物中,对照人群中均没有检出MRSA ST9,且MRSA ST9是亚洲地区广泛流行的动物源性MRSA,提示MRSA ST9可能由动物跨宿主传播给人群,从而导致LA-MRSA在人群的定植、感染。ST2359 MRSA(属于CC9)属于亚洲广泛流行的动物源性MRSA,本研究中仅见于环境和从业人员中,对照人群均没有携带这种动物源性MRSA,由此提示这种动物源性ST2359 MRSA有从动物或环境传播给人群定植、感染的可能性。(4)人群相关的ST7 MRSA、ST59 MRSA在环境、从业人员、对照人群中均有携带,提示环境中ST7 MRSA、ST59 MRSA是人群MRSA感染的潜在来源。