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妥布霉素是临床使用的重要抗生素,其产业化生产菌黑暗链霉菌Tt-49主产安普霉素、氨甲酰妥布霉素和妥布霉素等复合物。利用基因工程技术,先阻断安普霉素的生物合成,后进一步阻止氨甲酰基修饰,获得单组分妥布霉素工程菌。在此基础上,插入可能负责庆大霉素C3’,C4’脱羟基作用的基因模块,探索其与安普霉素和妥布霉素生物合成基因组合的可能性。具体内容如下：1.aprH基因缺失突变株TH304的构建：构建重组质粒pTH407,经接合转移导入黑暗链霉菌Tt-49,得到单交换工程菌TH303。经松弛培养后,利用影印筛选和PCR鉴定,获得aprH基因缺失突变株TH304。经发酵检测,TH304生产力约2250μ/mL,为Tt-49的75%。TLC分析和MS分析确认,TH304不再合成安普霉素,主要积累氨甲酰妥布霉素。但与Tt-49相比,TH304生长周期较长,产孢能力差,不利于生产上的应用。2. aprJ基因缺失突变株TJ302的构建：构建重组质粒pTJ401,导入黑暗链霉菌Tt-49,获得aprJ基因缺失突变株TJ302。发酵结果显示,TJ302不再合成安普霉素,主要积累氨甲酰妥布霉素,总效价约2500 μ/mL,为Tt-49的85%。经考察发现,TJ302生长性状稳定,适合进一步改造。3. tobZ基因缺失突变株TJZ308的构建：将重组质粒pTZ501,导入黑暗链霉菌TJ302,获得tobZ基因缺失突变株TJZ308。发酵结果显示,TJZ308为单组分妥布霉素产生菌,且发酵单位与TJ302相近。发酵提取妥布霉素无需层析分离,就能达到药典规定的质量标准,解决了困扰企业几十年的关键技术难题,填补了国内外的研究空白。4.庆大霉素3’,4’脱羟基酶基因与妥布霉素生物合成基因的组合研究：构建将红霉素启动子ermE*组装于genB3-P-B4基因模块上游的重组质粒pZP606,导入黑暗链霉菌TJZ308,组合至妥布霉素生物合成基因簇的tobZ位点,获得工程菌TZP310。发酵结果显示,TZP310发酵单位显著下降,仅300μ/mL左右。经MS分析确认,genB3-P-B4基因模块的插入,破坏了妥布霉素的正常合成,使代谢产物停滞于尼泊拉胺。5.庆大霉素3’,4’脱羟基酶基因与安普霉素生物合成基因的组合研究：构建重组质粒pDP605,导入黑暗链霉菌ST314,组合至安普霉素生物合成基因簇的aprD3-D4位点,获得工程菌TDP306,其发酵单位与ST314相近。经MS分析确认,TDP306仍积累卡那霉素B, genB3-P-B4基因模块的插入,并未达到定向合成地贝卡星的预期效果。但确定了外源基因的插入位点,为进一步研究庆大霉素3’,4’脱羟基酶基因在链霉菌中的表达,生物合成地贝卡星奠定了基础。