猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)又名Aujeszky病(简称AD)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种具有高传染性的病毒性疾病。猪是PRV的天然宿主，也是唯一可潜伏携带该病毒的动物。猪伪狂犬病毒于20世纪50年代在中国首次报道，2011年中国部分地区大规模暴发了新型伪狂犬病毒，对我国养猪业造成了巨大的经济损失。gE蛋白是PRV复制非必需的囊膜糖蛋白，并且是PRV的主要毒力蛋白。由于目前临床上普遍使用gE基因缺失疫苗，gE对于区分鉴别野毒感染和疫苗接种动物有着极其重要的意义。因此开发更加特异且灵敏的gE抗体快速检测方法，对PRV的防控和净化至关重要。
　　毕赤酵母表达系统可对外源蛋白进行翻译后糖基化修饰，使外源蛋白的结构更接近于天然蛋白，是表达外源蛋白较为理想的真核表达系统。本研究利用毕赤酵母表达系统进行了gE重组蛋白的表达，通过镍柱亲和层析对gE重组蛋白进行纯化，并建立了基于该蛋白的gE抗体间接ELISA检测方法。将gE重组蛋白免疫小鼠后，采用IPMA筛选得到了针对gE重组蛋白的单克隆抗体。主要工作内容及结果如下:
　　1.gE重组蛋白的表达及鉴定
　　为获得蛋白结构更接近于天然蛋白的gE重组蛋白，本研究将PRVTJ株gE基因序列片段克隆到pPICZαA表达载体上，通过PCR鉴定，结果显示成功构建了表达载体pPICZαA-gE。通过单酶切表达载体pPICZαA-gE使其线性化后，经电转化进入X-33酵母感受态，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，结果显示gE基因片段成功整合至X-33酵母基因组。阳性单克隆菌落经培养后用甲醇进行诱导表达，通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定，结果显示成功分泌表达了gE重组蛋白。
　　2.gE重组蛋白的纯化及活性鉴定
　　为获得高纯度的gE重组蛋白，本研究通过镍柱亲和层析纯化了gE重组蛋白，SDS-PAGE鉴定结果显示，纯化后的gE重组蛋白纯度可达90％以上。Western-blot鉴定结果显示，gE重组蛋白与His单抗及阳性血清的反应性良好。经BCA蛋白定量试剂盒检测，其浓度为0.85mg/mL。Dot-Blot检测结果显示，gE重组蛋白的体外活性良好。
　　3.间接ELISA检测方法的建立
　　为建立基于gE重组蛋白的gE抗体间接ELISA检测方法，通过对不同反应条件的摸索，成功建立了最佳反应条件的间接ELISA检测方法。用建立的间接ELISA检测方法检测PRV猪阴性血清，计算得到其阴阳性血清临界值为0.329。通过检测猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒的猪阳性血清，结果表明该间接ELISA方法的特异性良好。
　　4.单克隆抗体的筛选及鉴定
　　为获得针对gE蛋白的单克隆抗体，将gE重组蛋白免疫BALB/c小鼠，采用IPMA检测杂交瘤细胞上清，结果显示成功获得4株单克隆抗体，分别命名为2F10、4C10、9E1、10C3。Western-blot鉴定结果显示，4株单克隆抗体与gE重组蛋白的反应性良好。ELISA效价测定结果显示，4株单克隆抗体的效价均可达105以上。亚型鉴定结果显示，2F10、4C10、10C3三株单克隆抗体均属于IgG2b亚类，而9E1属于IgG1亚类;4株单克隆抗体的轻链均为K链。
　　综上，本研究成功获得了毕赤酵母表达的高纯度且活性良好的gE重组蛋白，并建立了gE抗体间接ELISA检测方法，免疫小鼠后筛选得到4株亲和力良好的单克隆抗体。本研究为开发特异且灵敏的gE抗体快速检测技术奠定了基础。