【摘 要】
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目的:1,根据Cre/LoxP系统构建软骨组织特异性过表达miR-1(Col2a1-Cre-ERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1)小鼠并进行相应的基因学验证。2,通过组织学和影像学技术观察miR-1过表达是否会影响小鼠的软骨发育。3,探讨miR-1过表达小鼠出现四肢短小以及二次骨化中心延迟的分子生物学机制。方法:1,Col2a1-Cre-ERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1小鼠
【基金项目】
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国家自然科学基金“山西省基础研究计划自然科学研究面上项目microRNA-1在关节软骨生长发育中的作用及机制研究（编号20210302123263）”；
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目的:1,根据Cre/LoxP系统构建软骨组织特异性过表达miR-1(Col2a1-Cre-ERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1)小鼠并进行相应的基因学验证。2,通过组织学和影像学技术观察miR-1过表达是否会影响小鼠的软骨发育。3,探讨miR-1过表达小鼠出现四肢短小以及二次骨化中心延迟的分子生物学机制。方法:1,Col2a1-Cre-ERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1小鼠基因学验证:（1）使用琼脂糖凝胶电泳进行基因学鉴定。（2）筛选出合适的基因型小鼠进行交配繁殖,并对新生小鼠注射他莫昔芬,通过q RT-PCR分析miR-1的表达情况。（3）通过冰冻切片观察荧光变化进一步验证miR-1过表达小鼠是否构建成功。2,miR-1过表达转基因小鼠表型观察:（1）对实验组以及对照组小鼠通过大体观察,全身骨架染色,四肢长度,体长,体重以及尾长等变化分析miR-1过表达小鼠是否出现四肢短小。（2）收集出生后不同时间点小鼠,对实验组以及对照组小鼠进行X线扫描,番红O/固绿染色,全身骨架染色以及micro CT扫描来分析miR-1过表达是否影响小鼠二次骨化中心的形成。（3）通过HE染色观察miR-1过表达对小鼠二次骨化中心以及生长板影响。3,miR-1影响软骨发育的机制探讨:（1）通过免疫组织化学染色,CCK8分析以及HE染色分析miR-1过表达时对生长板发育产生影响。（2）通过细胞培养以及免疫组织化学染色检测miR-1通过IHH信号通路来影响软骨发育的机制。结果:1,琼脂糖凝胶电泳结果显示:Col2a1-Cre-ERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1小鼠不仅在350bp处有一miR-1位点并且在598bp处有一Col2-cre位点。冰冻切片结果显示在注射他莫昔芬以前Col2a1-Cre-ERT2/GFPfl/fl-RFP-miR-1小鼠本身携带绿色荧光,而在注射他莫昔芬之后小鼠本身表达的绿色荧光消失,从而表达红色荧光。q RT-PCR检测与对照组相比实验组小鼠生长板组织miR-1的表达量显著增加。2,通过对小鼠大体观察发现:条件性miR-1过表达转基因小鼠体长、体重、股骨以及胫骨等均比对照组小鼠短。通过X线、全身骨架染色、番红O/固绿染色等发现实验组小鼠二次骨化中心形成明显滞后于正常对照小鼠。通过HE染色发现实验组小鼠生长板长度比正常对照小鼠长,且生长板增殖区以及肥大区均出现异常。3,免疫组化染色以及CCK-8分析结果显示:实验组小鼠PCNA,Ki67的表达量显著低于正常对照小鼠;CCK-8结果显示培养48小时后实验组小鼠软骨细胞的增殖情况明显低于对照组小鼠。免疫组化的结果显示实验组Runx2、ColⅩ、MMP-13、Sox9、ColⅡ、骨钙素、ColⅠ以及IHH的表达量均低于对照组,WB分析结果显示IHH通路相关指标Smo、Gli1的表达实验组也低于对照组。q RT-PCR检测结果与免疫组织化学染色的结果一致。结论:本研究结果显示,低水平的miR-1对维持小鼠生长板软骨细胞的正常发育至关重要,软骨细胞过表达miR-1通过抑制其增殖及肥大分化,最终导致小鼠出现身材矮小,四肢缩短,二次骨化中心形成延迟等现象,而整个影响可能是通过IHH信号通路来发挥作用。
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