背景原发性脑出血具有极高的致残率和致死率,在出血后复杂的病理进程中,继发性脑水肿是脑出血后神经功能障碍的形成或导致病人致死的关键因素。研究证实脑出血后脑水肿的发生、发展与水通道蛋白-4(aquaporin-4, AQP4)的表达异常有关。AQP4是脑内最主要的水转运蛋白,它主要分布部位是脑实质和脑内液体腔的边界上,比如血管周围星形胶质细胞的足突,胶质界膜,室管膜细胞,它使水沿着渗透压和静水压梯度从高向低流动。在不同的病理模型实验中,AQP4展现了对水的双向转运能力,它既可以在细胞毒性脑水肿中参与脑水肿的产生,也可以在血管源性脑水肿中参与脑水肿的清除。因此,针对脑水肿的治疗,AQP4可以成为潜在的药物治疗靶点,在细胞毒性的脑水肿中通过抑制AQP4的功能有利于减轻水肿,而在血管源性的脑水肿中通过促进其功能有利于减轻水肿。在对AQP4调控的研究中发现,AQP4可以在一定条件下出现亚细胞定位的改变。包括AQP4在内的部分膜蛋白,可以通过内吞的方式发生内化(internalization),甚至还可以分选(sorting)至溶酶体而降解。AQP4内化可以使其亚细胞定位发生改变,从而影响它在水平衡、水转运中的调节作用。目前,关于脑出血后AQP4的表达变化是否与其内化以及溶酶体降解有关尚未见报道。因此,本课题拟从在体和离体两方面展开研究。通过胶原酶诱导大鼠脑出血模型,观察在脑出血后脑水肿的发生发展过程中是否存在AQP4内化和溶酶体分选的现象,并通过凝血酶处理来制作脑出血的细胞模型,检测AQP4锚定的关键分子a-syntrophin的表达,探讨它和AQP4内化的关系,为临床脑出血所致的脑水肿的治疗提供实验基础。研究目的1.研究脑出血后脑水肿的发生发展过程中,是否存在AQP4内化和溶酶体分选现象,并探讨其在脑水肿发生发展中的作用。2.凝血酶处理对原代星形胶质细胞AQP4内化的影响,并探讨AQP4锚定的关键分子a-syntrophin和AQP4内化的关系。研究内容和方法1.健康成年雄性SD (Sprague-Dawley)大鼠114只,随机分为脑出血组(intracerebral hemorrhage, ICH)和假手术组造模。采用右侧尾状核缓慢注射细菌性胶原酶2μl(0.25 U/μl)制作ICH模型,并分别在术后6 h,12 h,24 h,48 h,72 h进行检测。采用HE染色观察脑出血后的血肿病理,并使用透射电镜观察脑出血后早期脑内的超微结构,以明确脑出血后早期脑水肿的类型；使用干湿重法检测各组各时间点的脑组织含水量BWC (brain water content)的变化,用伊文氏蓝EB (Evans blue)作为示踪剂检测脑出血后血脑屏障的完整性；使用q-PCR和Western blot技术检测脑出血后AQP4的mRNA和蛋白表达变化；采用免疫荧光双标技术检测AQP4分别与晚期内涵体标记物(mannose-6-phosphate receptor, MPR)和溶酶体标记物(lysosomalassociated membrane protein-1, LAMP1)的共表达,使用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0测定AQP4与LAMP1共表达的比例；2.取新生SD大鼠(2 d内)的大脑皮质进行星形胶质细胞的原代培养,随机分为凝血酶处理组和对照组,对照组不做任何处理,凝血酶组用100 U/ml凝血酶处理细胞24 h后继续培养。采用乳酸脱氢酶(lactic acid dehydrogenase, LDH)释放法检测凝血酶对细胞的毒性作用；用免疫荧光染色检测细胞的AQP4表达；采用免疫荧光双标技术检测AQP4分别与MPR和LAMP1的共表达,AQP4与a-syntrophin的共表达；使用Western blot技术检测两组细胞AQP4和a-syntrophin蛋白的表达变化。结果1.大鼠脑出血后AQP4内化和溶酶体分选：①病理观察：ICH后1d星形胶质细胞的足突肿胀明显,内皮被覆的基膜不完整而且出现肿胀,血管周围间隙增宽；②BWC在ICH后3h开始升高,到6h则明显增高(P<0.05),48 h到达峰值；EB在ICH后1h就可见到从血管渗出,ICH后6h明显增高(P<0.01),达到峰值。③QP4 mRNA在ICH后24 h,48 h和72 h都出现了明显的增高(P<0.01),其上调峰值出现在ICH后24 h；AQP4蛋白在ICH后12h开始明显上调(P<0.05),至24 h升至其峰值(P<0.01)。④ICH后各时间点(6h,12 h,24h,48h),在脉络丛,血肿周围,大脑皮质都可以看到AQP4和MPR以及AQP4和LAMP1的共定位表达。AQP4和LAMP1共表达比例的计算显示共表达量随着ICH后的时间呈现依赖关系,与对照组相比,共表达比例具有统计学意义(P<0.05)。2.凝血酶处理对AQP4星形胶质细胞表达的影响①凝血酶处理导致星形胶质细胞的死亡率为30.17%±2.79%；②对照组,AQP4呈簇状或线状分布于星形胶质细胞膜；凝血酶组AQP4既呈点簇状分布于细胞膜,更多的则是细小颗粒状分布于细胞浆内,AQP4蛋白的表达在凝血酶处理之后并没有明显变化。③凝血酶处理星形胶质细胞以后,AQP4与MPR及LAMP1均出现了共表达的情况；④凝血酶处理使得a-syntrophin在星形胶质细胞上的表达明显减弱,蛋白表达明显降低,统计学分析有显著差异(P<0.01)。结论1.大鼠脑出血后脑水肿发生发展过程中,伴随着AQP4 mRNA和蛋白的水平上调,可以观察到AQP4内化到了晚期内涵体,部分内化的AQP4可以分选至溶酶体被降解。2.凝血酶处理可以导致星形胶质细胞膜上的AQP4内化并进一步分选至溶酶体而降解。凝血酶处理后AQP4和a-syntrophin的共表达及其微弱,同时a-syntrophin蛋白表达明显降低,其表达的减少直接影响了AQP4在细胞膜上的锚定,造成了AQP4表达部位的变化。