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热稳定性差和酶活性低是饲用β-1，3-1，4-葡聚糖酶（EC3.2.1.73，以下简称β-葡聚糖酶）生产和应用的瓶颈。针对这一难题，本研究的基本思路是:通过筛选具有较高酶活性的基因和构建高拷贝、强启动子的β-葡聚糖酶重组质粒来提高酶的活性;通过重组决定嗜热梭菌酶热稳定性的结构域来提高酶的热稳定性。技术路线是:在分析了酶的一级和高级结构的基础上，以结构域为单位，采用结构域重组方法和SOE基因拼接技术，构建了既耐热又在生理温度下酶活高的β-葡聚糖酶;并系统地分析了表达产物活性和酶热稳定性。主要研究结果如下: 1.产酶菌的筛选 根据文献报导并采用水解大麦β-葡聚糖透明圈技术，筛选出具有β-葡聚糖酶活性的四种微生物。单位发酵液中，测定酶的活性，β-葡聚糖酶活性由高到低为短小芽孢杆菌酶(90.66U/mL，简称PUM)、淀粉液化芽孢杆菌酶(64.0U/mL，AMY)、嗜热梭菌酶(19.6U/mL，CLO)和地衣芽孢杆菌酶(10.13U/mL，LIC)。 2.热稳定性好和酶活性高的基因筛选 为了真实地反映酶基因在大肠杆菌中的表达情况，首先克隆了地衣、淀粉、短小芽孢杆菌和嗜热梭菌的β-葡聚糖酶基因，并与pGEM(@)-T Easy vector连接，构建重组克隆载体。测序表明，它们的β-葡聚糖酶基因大小分别为818bp(GenBank No.AY225317)、843bp(AY205562.1)、754bp(AY164456)和1040bp(AY225318)。上述基因用相同表达载体(pET-30a)、相同酶切位点(5加BamHⅠ，3加XhoⅠ)在E.coli BL21中表达，SDS-PAGE凝胶电泳显示三种芽孢杆菌β-葡聚糖酶均获得27kDa左右的特异性条带，嗜热梭菌酶获得37kDa左右的特异性条带，均与四种酶的理论分子量接近。 分离和纯化了四个β-葡聚糖酶基因工程菌的表达产物，对它们的酶学特性进行较为系统的分析。单位发酵液中地衣、淀粉、短小三种芽孢杆菌和嗜热梭菌β-葡聚糖酶的活性分别为123.68U/mL（最适温度50℃、最适pH7～8之间）、156.24U/mL（最适温度60℃、最适pH5）、14.48U/mL（最适温度50℃、最适pH5）和58.6U/mL（最适温度80℃、最适pH9），除短小芽孢杆菌β-葡聚糖酶外，其余三个较原始产酶菌的酶活均有不同程度的提高。在耐热性方面，嗜热梭菌酶的耐热性最好，70℃仍有85％的存活率，而地衣、淀粉和短小芽孢杆菌酶的存活率分别为7％、34％和10％。从以上分析确定淀粉液化芽孢杆菌和嗜热梭菌分别为酶活高的基因和热稳定性好的基因。从四种酶的氨基酸组成分析，发现嗜热梭菌酶的蛋白质中Ile、Pro、Glu和Arg的含量均高于芽孢杆菌的酶，这是该酶耐热的原因之一。 3.构建耐热、高酶活β-葡聚糖酶 3.1 构建方法: 通过基因的一级结构分析，发现嗜热梭菌与芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因相比，基因的5端与芽孢杆菌酶具有较高的同源性，基因的3端多了310个碱基，是由两个近似重复序列（含24个氨基酸）组成;高级结构分析表明:嗜热梭菌酶的C-端是由两个α-螺旋组成，并且在酶分子的裂缝处;为了进一步分析该结构域的功能，我们将淀粉液化芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因的编码序列和该结构域相连，构建重组酶AC，发现该结构域对酶的分泌和比活有很大的促进作用，而对酶的耐热性影响较小。揭示了嗜热梭菌β-葡聚糖酶耐热的原因主要在N-端。 由于结构域是蛋白质的结构、功能和折叠单位，它是结构与功能的纽带，为此我们以嗜热梭菌β-葡聚糖酶N-端结构域稳定淀粉液化芽孢杆菌酶为理念，以酶的高级结构预测为实验指导，从结构域重组，构建了既耐热又酶活高的β-葡聚糖酶重组基因CAC。 3.2 酶的活性: 最适温度70℃左右，40℃的相对活性是86％，在最适条件下总酶活为390.6U/mL;在40℃、pH6.0的条件下，酶活为234.4U/mL，分别是工程菌淀粉液化芽孢杆菌酶和嗜热梭菌酶的4倍和14倍。经原子力显微镜观察，β-葡聚糖呈网状结构，当酶与ββ-葡聚糖反应后，β-葡聚糖的结构被破坏。 3.3 酶的热稳定性: 80℃、90℃、和100℃处理2min时，酶的相对活性分别为为89％、33％和26％。而嗜热梭菌酶的存活率分别为42％和5％和0％，淀粉液化芽孢杆菌酶的存活率分别为7％、5％和0％。 3.4 酶与pH值: 最适pH6.0～7.0之间，pH6.0时（在动物消化道pH范围）相对酶活性为91％。在稳定性上，酶在pH6、7和9的条件下稳定，酶的存活率分别为97％、98％和95％，而pH8时酶的存活率相对较低(81％)，pH3、4、5时酶的存活率分别为65％、78％和80％。 3.5 酶的分泌性: 重组酶CAC的分泌酶（胞间酶和胞外酶）占总酶的71％。 3.6 动物的胃肠环境对酶的影响: 在模拟的胃和小肠液的环境中，酶的存活率分别为33％和84％，在模拟的胃液和肠液混合的条件下，酶的存活率为66％;在42日龄AA肉鸡的胃液和小肠液对酶处理后，酶的存活率为63％。 综上所述，重组酶达到预期日标，是理想的饲料酶制剂。