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肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)死亡率居我国癌症死亡的第3位,也是世界上因肿瘤死亡的重要原因之一。乙肝病毒X基因(hepatitis B virus X gene, HBx)与HCC的形成关系密切,中国的肝癌90%以上为乙肝相关性肝癌HBx特有的反式激活功能可能是HBV引起肝细胞恶变的主要原因,也是近年研究的热点之一。乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBX)是一种多功能蛋白,广泛参与病毒的复制、宿主细胞的基因调控和表达、蛋白质降解及信号转导等过程,在原发性肝细胞癌的发生发展中起关键作用。十多年前对乙肝病毒X基因(HBx)及其蛋白有很多的研究,但是仅仅确立了其在感染HBV的HCC中促癌的特点,对于其在癌变转移、侵袭等恶性表型的研究尚不深入,而且对于其作用机制的研究尚需深入研究。近年来随着分子生物学技术的发展以及相关学科的发展,给核苷(酸)类似物抗乙肝病毒时代提出了要求,对于HBV在HCC发生发展中的作用需要更进一步的探讨。本研究创新点在于首次把pcDNA3.1(-)-X重组质粒转染到低侵袭性的人肝癌细胞株SMMC-7721中,并探讨了HBX和一些致癌和促进癌变发生发展的细胞因子、蛋白质的关系,可能会对以后的研究提供一些思路和参考。本研究的目的：1、利用免疫组织化学方法检测HCC癌组织、癌旁组织及正常肝组织中HBX、骨桥蛋白(OPN)及基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达情况,探讨HBX、OPN、MMP-9与HCC的关系,揭示HCC发生及转移复发的分子机制；2、将pcDNA3.1(-)-X重组质粒转染到低侵袭性人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,观察HBX对转染细胞恶性表型的影响；3、将转染pcDNA3.1(-)-X的SMMC-7721细胞接种到小鼠体内,检测肿瘤组织内HBX、尿激酶纤溶酶原活化因子(uPA)及NF-κB的表达,NF-κB的DNA结合活性,进一步揭示HBx在HCC发生发展中的重要作用及其机制,为HCC发生、转移和复发的防治提供依据,并对后续的研究提供思路。第一部分HBX、基质金属蛋白酶-9和骨桥蛋白在乙肝相关性肝细胞癌中的表达及其意义的研究方法利用免疫组织化学方法检测HCC癌组织、癌旁组织及正常肝组织中HBX、OPN和MMP-9的表达。结果1. HBX、MMP-9和OPN在癌组织、癌旁组织中多呈阳性表达,在正常肝组织中呈阴性表达。主要位于细胞浆中,部分位于胞核内,光镜下呈棕黄色。HBX、MMP-9与OPN在癌组织中的表达率分别为69.4%、81.7%、61.2%,在癌旁组织中的表达率分别为57.1%、71.4%、79.6%,其表达强度明显高于正常肝组织(P<0.05)。HBX与OPN在癌组织与癌旁组织间的表达无显著差异；而MMP-9在癌旁组织中的表达强度高于癌组织,有显著差异性。癌组织与正常组间差异明显(P<0.05)。2. HBX、MMP-9和OPN在有转移及癌周浸润的癌组织中的表达阳性率分别为82.7%、93.1%、75.9%,明显高于无转移及无癌周浸润者,后者的表达阳性率分别为50%、65%、40%,差异有显著性(P<0.05)。3.OPN及MMP-9在癌组织、癌旁组织中的表达与HBX表达具有相关性,相关系数分别为0.516、0.426和0.498、0.537,均有显著意义(P<0.01),呈直线正相关。第二部分HBX促进人肝癌细胞株SMMC-7721增殖及恶性表型的实验研究方法pcDNA3.1(-)-X重组质粒转染SMMC-7721细胞,以空质粒转染作对照,RT-PCR及Western blot检测法转染细胞HBX的表达情况,ELISA法检测细胞HBX、MMP-2、MMP-9、uPA的表达水平,并检测转染细胞的体外增殖、粘附、侵袭及运动能力。结果1.我们应用半定量RT-PCR法检测转染pcDNA3.1(-)-X的SMMC-7721细胞中HBX的表达,β-actin作对照。检测结果提示：β-actin RT-PCR产物大小为190bp,pcDNA3.1(-)-X转染的SMMC-7721绌胞RNA捉取物RT-PCR产物大小为402bp,而空质粒RT-PCR结果为阴性。裂解转染的SMMC-7721细胞提取蛋白进行Western blot分析,重组质粒转染组在大于.Mr约20×103以上电泳区域内可见一特异性蛋白带,空载体转染组未见相应蛋白条带。2.ELISA法检测细胞内及培养上清液中HBX、MMP-9、MMP-2及uPA的表达水平。结果显示：重组质粒转染组上述蛋白的表达水平分别为：(13.02±2.12)ng/ml、(27.82±2.25) ng/ml、(49.04±4.07) ng/ml和(10.78±3.23) ng/ml,对照组上述蛋白的表达水平分别为：(4.07±0.37) ng/ml、(7.89±1.27) ng/m、(25.15±5.43) ng/ml和(1.24±0.34) ng/ml,重组质粒转染组上述蛋白的表达水平明显高于空质粒转染组,t值分别为19.93,6.27,6.83和7.04,P均<0.01。3.体外功能试验结果提示：重组质粒转染SMMC-7721细胞后,其增殖、黏附、运动和侵袭能力明显增强,重组质粒转染细胞的黏附率为85.33±14.78%,对照组为57.34%+2.52%,t=2.96,P<0.05。运动试验透膜细胞数分别为(18.2±3.2)个和(9.3±2.3)个,t=4.21,P<0.05。侵袭试验透膜细胞数分别为(8.2±1.53)个和(4.1±1.29)个,t=4.11,P<0.05。第三部分HBX重组质粒转染SMMC-7721细胞裸鼠荷瘤实验方法将裸鼠随机分为4组,每组5只,分别为理组(A组)、pcDNA3.1(-)/ SMMC-7721细胞处理组(B组)和pcDNA3.1(-)-X/SMMC-7721细胞处理组(C组)及PBS处理组(D组)。取对数生长期的培养细胞,当细胞融合度达90%左右时,用胰酶消化,将5×106细胞/100μ1的细胞注入裸鼠左侧腋下皮下,每次注射100μ1,观察肿瘤的生长情况及裸鼠生存状况。四周后处死小鼠,测量肿瘤的体积,RT-PCR法及免疫组织化学法检测小鼠肿瘤组织内HBX和uPA的表达,电泳迁移率变动分析法检测NF-κB的DNA结合活性。结果1.与SMMC-7721处理组(A)及pcDNA3.1()/SMMC-7721处理组(V)相比,pcDNA3.1(-)-X/SMMC-7721处理组(C组)小鼠注射部位的肿瘤生长速度较快,肿瘤体积较大,三组的成瘤时间分别为：11.79±0.25天、10.83±0.47天和7.57±0.67天,A组与B组之间无显著性差异(P>0.05),但与C组有显著性差异(P<0.05)；PBS阴性对照组未见肿瘤生长。荷瘤饲养4周后采用颈椎脱臼法处死裸鼠。A组、B组和C组的肿瘤体积分别为0.79±0.65cm3,0.57±0.49 cm3和2.49±0.38 cm3。A组和B组两者之间无显著性差异(P>0.05),但与C组之间有显著性差异(P<0.05)。2. pcDNA3.1(-)-X/SMMC-7721细胞处理组小鼠的肿瘤组织内HBX和uPA染色呈阳性,产物主要位于细胞浆中,光镜下呈棕黄色,而其他组染色呈阴性或弱阳性。3. uPA RT-PCR产物大小为366bp,β-actin RT-PCR产物大小为190bp,与对照组相比,pcDNA3.1(-)-X/SMMC-7721细胞处理组小鼠荷瘤组织中uPA mRNA的水平升高了2倍以上,pcDNA3.1(-)-X/SMMC-7721细胞处理组小鼠荷瘤组织中HBX mRNA的大小为402bp,而对照组为阴性。4.与其他对照组相比,pcDNA3.1(-)-X/SMMC-7721细胞处理组小鼠肿瘤组织细胞核提取物显示较强的DNA结合活性。结论1. HBX. MMP-9和OPN在人HCC的发生、发展、转移和复发中起着重要作用。HBX可能刺激OPN的表达,而MMP-9可能和OPN的表达有潜在的联系。2.HBX是促进SMMC-7721细胞恶性表型的关键因素之一,可能通过MMP-2、MMP-9、uPA的分泌促进SMMC-7721细胞的恶性表型。3.HBX可能通过NF-κB通路分泌uPA、MMP-9等促进裸鼠体内肝癌细胞SMMC-7721细胞的恶性表型和促进肝癌的发生和发展。对此,尚需进一步的深入研究。