微孢子虫(Microsporidia)是一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物,与其他细胞内寄生虫相似,微孢子虫具特有的侵染机制。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是Nageli于1857年在病蚕中分离鉴定到的,它能够感染家蚕,引发家蚕微粒子病,是蚕业生产上的毁灭性病害,因此如何在家蚕感染早期检测出家蚕微孢子虫并进行防治,在蚕业上至关重要。1870年,巴斯德创立了母蛾镜检法来检测家蚕微孢子虫,多年来此方法一直沿用至今,是生产上用于检测的传统方法。截止目前,家蚕微孢子虫的检测经历了以下阶段：显微镜检、分子生物学检测、免疫学检测。母蛾镜检方法具有简便、快速、不需要高端仪器的优点,但是此方法依赖检验人员的判断,主观性强。科学家发现利用染色可以提高微孢子虫的检出率。透射电子显微镜可以观察到孢子虫的超微结构,可以根据孢子壁厚度、极管圈数与倾角等基本确定微孢子的种类。随着分子生物学的发展,PCR(聚合酶链式反应)技术、LAMP(环介导的等温扩增技术)被用到微孢子虫检测上来。近年来,针对微孢子虫种间孢壁蛋白抗原性的不同,逐步发展起了一些免疫学检测方法。胶体金免疫层析(GICA)就是利用胶体金本身的显色特点结合免疫层析技术对待检样品进行检测。利用这一原理研制的快速检测试纸在医学诊断、病原检测等领域发挥了巨大作用。2009年本实验室利用的家蚕微孢子虫单克隆抗体G9和孢子发芽液的兔多抗组装了试纸条,分别对孢子、感染孢子的母蛾进行了检测,但还有基础问题未得到解决,包括试纸条的特异性以及单抗针对的靶蛋白都未确定。基于以上问题,本文对试纸条进行了特异性、灵敏性的分析,利用免疫沉淀结合LTQ质谱分析的方法找到了单克隆抗体G9的靶蛋白。主要研究结果如下：1.家蚕微孢子虫检测试纸灵敏性及特异性分析由于前期实验室制备的试纸条采用的是将孢子碱处理发芽后的混合物用点膜的方法检测的,试纸条检测的靶标存在孢子碱处理后的上清还是沉淀中,尚不清楚,于是我们对孢子碱处理后的组分进行分析,将碱处理的上清和沉淀分开检测,发现试纸条检测靶标存在于碱处理后的上清中。对检测试纸的检测性能进行分析,开展了特异性性和灵敏性实验。特异性实验方面,将柞蚕微孢子虫(Nosema antheraeae)、家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhydrosis virus,BmNPV)、家蚕变形微孢子虫(Vairimorpha bombycis)在试纸条上进行检测,发现家蚕核型多角体病毒出现非特异性信号。灵敏性实验中,用0.1molL的KOH溶液20μL分别处理约108、107、106、105个孢子,在试纸条上经点膜法检测后发现只有当孢子数量为108、107个时才能够在试纸条上出现检测信号,重复实验两次,均得出相同结果。然后用Bradford法测碱处理约108、107个孢子碱处理后上清中蛋白浓度,发现两次测得的平均值分别是1.76μg/μL、0.17μg/μL。说明试纸条检测的最低检测量为0.17μg/μL。2.家蚕微孢子虫碱溶处理条件的优化由于试纸条检测靶标存在于碱处理后的上清中,因此本章中对碱处理后的上清(碱溶蛋白)进行研究,同时探索碱溶蛋白的最佳提取条件。首先对碱溶蛋白特异条带进行LTQ质谱鉴定,结果显示是SWP1。对不同碱性溶液、不同浓度、不同时间、不同温度、不同pH、不同家蚕发育阶段提取孢子的条件下提取的碱溶蛋白进行了分析。发现用氢氧化钾、氢氧化钠以及碳酸钾提取的碱溶蛋白均在大小为30kDa处有主带。不同浓度碱性溶液处理时,30kDa附近主带首先出现,随着浓度增大,蛋白条带变丰富。不同处理时间条件下分析碱溶蛋白,发现处理5min之后碱溶蛋白就可以在电泳上检测到条带,处理90min后蛋白条带不会增加,且90min以内在66kDa附近有蛋白条带出现,90min以后消失。从温度对碱溶蛋白的影响实验中可以看出60℃处理时15kDa附近出现单一的蛋白条带。在研究pH对碱溶蛋白的影响时,我们用0.1mol/L的KOH溶液提取碱溶蛋白,再将碱溶蛋白的pH用盐酸中和,分别调pH到8、9、10,电泳检测发现当pH变化时,碱溶蛋白的组分是稳定的。碱处理家蚕不同生活史时期提取的孢子时,发现在家蚕蛹期纯化的孢子中提取的碱溶蛋白30kDa附近蛋白量最多。本章节的研究对碱溶蛋白的组分有了初步了解并且探索到提取碱溶蛋白的最佳条件为：4-C,用0.1mol/L KOH或者NaOH溶液,处理时间不超过90min。3.家蚕微孢子虫单克隆抗体G9靶蛋白的鉴定分析由结果可知,试纸条能检测到的靶标存在于碱溶蛋白中,碱溶蛋白在试纸条上有检测信号,并且碱溶蛋白的主要组分是SWP1,而试纸条上使用的金标抗体是由单抗G9与胶体金结合而来,那么单抗G9的靶蛋白必然存在于碱处理后的上清中,因此我们设计了并开展了免疫沉淀、Western blotting等实验。结果表明,当用碱溶蛋白与MAb G9进行免疫沉淀实验时,单抗G9能从碱溶蛋白中沉淀出一条大小约为30kDa的蛋白,质谱鉴定结果为SWP1。为进一步验证质谱的结果,用重组SWP1兔抗与免疫沉淀的结果进行Western blotting,结果显示SWP1兔抗能识别免疫沉淀中特异的30kDa附近条带。随后利用重组SWP1兔抗与碱溶蛋白进行Western blotting实验、重组SWP1兔抗和MAb G9分别与碱溶蛋白进行酶联免疫吸附(ELISA)实验进行验证,结果均与免疫沉淀的蛋白免疫印迹实验结果一致。综上,证明单抗G9针对SWP1。确认了MAb G9的靶蛋白,就可以纯化和富集该蛋白制备该蛋白的高效价多抗,应用于试纸条上作为拦截线,改良点膜法,为进一步提高试纸条的灵敏性和特异性提供可能。