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负载IGF-1及BMP-2的新型组织工程软骨的实验研究目的关节软骨容易发生损伤和退变，再生能力差，对损伤软骨的实验治疗主要集中在细胞的治疗上，包括应用成熟软骨细胞及其他软骨祖细胞。脂肪间充质干细胞(ADSCs)作为成熟软骨细胞的替代品越来越受到重视。ADSCs可以很容易从脂肪组织中获得，增殖传代能力强，细胞均一性好，具多向分化潜能，能分化为各种类型组织，包括软骨和骨。但转移的ADSCs在软骨缺损部位还没有产生令人满意的关节软骨。一个可能的问题是局部没有足够能刺激移植细胞分化的细胞因子。体外研究报告显示，特异的蛋白因子能够促进成人ADSCs向软骨分化，提高体内软骨修复能力。相关的研究表明：TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，FGF，BMP-2，BMP-6，IGF-1等生长因子具有成软骨能力，因此可以在局部加入这些因子促进ADSCs细胞向软骨分化。但外源性细胞因子易于流失、作用时间短、价格昂贵。如果将这些细胞因子基因导入ADSCs中，通过自分泌相应细胞因子诱导ADSCs向软骨细胞分化，以此基因修饰的ADSCs作为种子细胞来构建组织工程软骨，用于软骨缺损和退变治疗具有重要意义。目前，应用IGF-1及BMP-2基因序贯转染ADSCs国内外均未见报道。本研究通过IGF-1及BMP-2基因转染ADSCs促使其向软骨细胞分化，我们采用Ⅰ型胶原酶消化法与贴壁培养法相结合，对存在于脂肪组织中的间充质干细胞进行分离、纯化培养和体外扩增，并对其生物学特性进行初步研究。通过阳离子脂质体介导的基因转染将IGF-1转入ADSCs，并筛选稳定转染细胞，然后以腺病毒为载体BMP-2基因序贯转染ADSCs，双基因联合诱导ADSCs向软骨细胞方向分化，通过Ⅱ型胶原、MMP-3等指标测定来判断是否稳定表达，以期为开展IGF-1及BMP-2基因联合治疗软骨缺损的研究奠定基础。材料与方法一、实验材料新西兰大白兔，由中国医科大学实验动物部提供二、实验方法1、兔脂肪间充质干细胞的分离培养及其生物学活性观察(1)兔脂肪间充质干细胞的培养采用Ⅰ型胶原酶消化后贴壁培养的方法，分离、纯化兔脂肪间充质干细胞，进行体外培养扩增。(2)向神经元样细胞诱导GM-1及β-巯基乙醇联合诱导向神经元样细胞分化。(3)生物学性状的观察用倒置显微镜每日观察细胞的生长情况并拍照。绘制P2代ADSCs细胞生长曲线。同时对比体外P1、P13代ADSCs的细胞周期构成。2、IGF-1及BMP-2双基因序贯转染脂肪间充质干细胞诱导其向软骨细胞分化的实验研究(1)真核表达质粒pcDNA3.1+IGF-1的扩增纯化及鉴定。(2)重组真核腺病毒表达载体Ad-BMP-2的扩增纯化及鉴定。(3)建立稳定表达pcDNA3.1+IGF-1-ADSCs细胞株，RT-PCR及Western blot检测IGF-1表达。(4)重组腺病毒表达载体Ad-BMP-2序贯转染稳定表达pcDNA3.1+IGF-1-ADSCs细胞株。RT-PCR检测BMP-2的表达。(5)相差显微镜观察细胞生长状态并1％甲苯胺蓝染色鉴定软骨结节。(6)绘制单基因及双基因转染后的细胞增殖曲线。(7)Western blot及免疫荧光检测Ⅱ型胶原蛋白表达。(8)Western blot检测MMP-3表达。(9)透射电镜观察细胞超微结构。3、以壳聚糖与明胶为原料制备成的生物支架复合负载有IGF-1及BMP-2基因的脂肪间充质干细胞构建三维组织工程软骨(1)以壳聚糖与明胶为原材料通过冷冻干燥真空致孔法制备生物复合支架。(2)将细胞与复合支架复合后联合培养。(3)扫描电镜观察细胞、支架的复合情况。结果1、兔脂肪间充质干细胞分离、纯化、培养成功(1)Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织后所分离得到的细胞大多为圆形单个核细胞，贴壁生长后原代细胞及传代细胞生长状态良好。各代细胞形态基本一致，都为长梭形。(2)经GM-1及β-巯基乙醇诱导组细胞NSE表达阳性。(3)绘制P2代ADSCs细胞生长曲线，通过分析可以看出ADSCs的增殖符合干细胞增殖规律，其增殖速度较快。2、通过IGF-1及BMP-2双基因联合诱导，ADSCs成功诱导分化成软骨样细胞(1)真核表达质粒pcDNA3.1+IGF-1扩增纯化成功。(2)重组真核腺病毒表达载体Ad-BMP-2的扩增纯化成功。(3)成功稳定转染ADSCs真核表达质粒pcDNA3.1+IGF-1。(4)IGF-1、BMP-2基因转染后细胞出现软骨结节。(5)单基因IGF-1及双基因IGF-1和BMP-2转染后细胞仍具有较高的增殖能力。(6)双基因转染IGF-1及BMP-2后细胞能够稳定表达Ⅱ型胶原，且表达量较单纯稳定转染IGF-1的表达量增高。(7)双基因转染IGF-1及BMP-2后的ADSCs其MMP-3的表达较单纯稳定转染IGF-1的ADSCs及未转染的ADSCs均有不同程度的降低。(8)双基因转染后细胞的超微结构提示细胞合成代谢旺盛，细胞功能活跃。3、以壳聚糖与明胶为原料制备成的生物支架复合负载有IGF-1及BMP-2的脂肪间充质干细胞构建三维组织工程软骨(1)以壳聚糖与明胶为原材料通过冷冻干燥真空致孔法成功制备成的生物复合支架，孔隙丰富利于细胞帖附。(2)该支架与诱导后细胞复合佳，细胞生长状态良好。结论1．、通过Ⅰ型胶原酶消化后贴壁培养的方法在体外能够成功培养出增殖能力强的兔脂肪间充质干细胞，可以作为组织工程的种子细胞。2、通过IGF-1及BMP-2的双基因序贯转染ADSCs成功诱导成软骨样细胞。3、经IGF-1及BMP-2双基因修饰后的ADSCs能够稳定表达Ⅱ型胶原蛋白。MMP-3表达较转染前明显降低。4、以壳聚糖与明胶为原材料通过冷冻干燥真空致孔法成功制备成的生物复合支架，与诱导后细胞相容性良好。