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丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族在响应胞外刺激时调控细胞的响应过程。p38作为该家族的成员之一,在真核生物应激响应过程中发挥重要作用。已有研究表明MAPK通路参与了昆虫耐寒机制的调控,本实验室虽然对拟步甲科荒漠昆虫小胸鳖甲(Microdera punctipennis)的低温生理机制已有大量研究,但对于小胸鳖甲的低温调控机制还不清楚。本文主要研究了小胸鳖甲p38信号通路与响应低温的关系,旨在说明MAPK通路是否参与了小胸鳖甲的抗冻机制。通过检测p38信号通路相关基因的低温表达谱发现该通路的大部分基因在低温条件下(4℃)上调表达,为了进一步研究该通路的主要因子在低温条件下的功能,选择上调表达的p38MAPK基因作为研究对象,以小胸鳖甲c DNA为模板扩增了p38的全长序列,利用大肠杆菌和酵母表达系统,对小胸鳖甲p38蛋白(Mpp38)的抗冻功能进行研究,具体内容及结果如下:1.小胸鳖甲p38信号通路相关基因低温表达谱分析。通过检测小胸鳖甲p38信号通路中MKKK(ASK1,MLK,TAK1,),MKK(MKK3,MKK4),MAPK(p38MAPK,MNK),下游激酶(MAPKAPK,MSK1),下游底物(Rho GDI,Tau,ATF4,ETS,Max,CREB1,p53)等基因的低温表达谱,我们发现除了与肿瘤、癌症等疾病相关的基因(TAK1,MNK,Rho GDI,Tau,ATF4,ETS,Max)不响应低温外,大部分与应激相关的基因(ASK1,MLK,MKK3,MKK4,p38MAPK,MAPKAPK2,MSK1,CREB1,p53)都响应低温而上调表达,说明p38信号通路可能参与了小胸鳖甲应对低温胁迫的调控机制。2.Mpp38的原核表达与增强细菌抗冻性分析。构建p ET28a-Mpp38表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,获得His-Mpp38融合蛋白。Western blot鉴定融合蛋白的正确表达。检测确认p38的磷酸化水平,说明Mpp38在细菌内能被磷酸化。通过低温(-10℃)处理转基因大肠杆菌的生长曲线发现BL21(p ET28a-Mpp38)比BL21(p ET28a)长得快,说明Mpp38蛋白在大肠杆菌抗冻过程中发挥作用。3.利用酵母系统对Mpp38蛋白进行功能研究。构建p YES-Mpp38真核表达载体并转化酿酒酵母(INVSCⅠ),经半乳糖诱导表达Mpp38蛋白,Western blot检测诱导不同时间后p38的磷酸化水平变化,发现随着诱导时间的延长,p38的磷酸化水平越来越高,而酵母细胞的p38对应物hog1的磷酸化水平无太大差异,但诱导30h后,hog1的磷酸化水平降低,甚至完全受到抑制。由此我们推测,小胸鳖甲p38在酵母细胞的外源过表达抑制了酿酒酵母内源hog1的磷酸化。通过对低温条件下酵母生长曲线检测发现INVSCⅠ(p YES2)的生长明显比INVSCⅠ(p YES2-Mpp38)快,说明外源Mpp38蛋白的表达影响了酵母响应低温时的正常生长。可能是Mpp38的过表达抑制了酵母hog1的表达,导致INVSCⅠ(p YES2-Mpp38)抗冻能力减弱。从酵母的滴板实验中发现,随着低温处理的时间的延长,INVSCⅠ(p YES2)和INVSCⅠ(p YES2-Mpp38)的菌落数越来越少,但INVSCⅠ(p YES2)的菌落数比INVSCⅠ(p YES2-Mpp38)的多,也说明了p38在酵母中的表达减弱了酿酒酵母的抗冻性,与生长曲线结果一致。为了进一步验证Mpp38对酿酒酵母抗冻的影响,我们又检测了转基因酵母的小分子渗透保护物质(海藻糖、甘油、脯氨酸)以及H2O2的含量,发现INVSCⅠ(p YES2)藻糖、甘油、脯氨酸物质含量都比INVSCⅠ(p YES2-Mpp38)高;说明Mpp38的表达降低了酵母响应低温时小分子渗透保护物质的积累。为了深入了解Mpp38对酵母hog1的抑制所带来的影响,我们检测了酵母HOG1通路低温相关基因的低温表达谱。-10℃促进INVSCⅠ(p YES2)中高渗透性甘油促分裂原活化蛋白激酶hog1、甘油三磷酸合成酶GPDH、海藻糖-6-磷酸合成酶TPS、水杨酸甲酯转移酶Ole等基因的表达,却抑制了INVSCⅠ(p YES2-Mpp38)中这些基因的表达,而对hog1上游基因PBS2(MAPKK)无影响。这些基因的表达情况与小分子物质含量的结果一致。说明Mpp38的过表达抑制了HOG1的活性,导致低温条件下hog1下游的基因表达受影响、小分子物质合成减少,进而降低酵母的抗冻能力。综上所述,通过检测小胸鳖甲p38信号通路中的16个基因在低温下的m RNA水平,确定p38MAPK信号通路参与小胸鳖甲对低温的响应。通过大肠杆菌与酵母系统验证p38MAPK基因的功能,证明在原核系统中,Mpp38可被大肠杆菌细胞磷酸化,并且提高了低温下大肠杆菌细胞内抗冻物质的积累,从而提高了细菌的抗冻能力。在酵母表达系统中,p38的表达抑制了酵母内源p38同源物hog1的磷酸化,阻断了酵母自身的HOG1通路,导致转基因酵母抗冻能力减弱。这一结果从反面证明小胸鳖甲p38通路参与细胞低温响应。但是p38作为hog1的同源基因,抑制hog1活性后却不能弥补其功能的原因有待进一步研究。