论文部分内容阅读
目的建立目标捕获和高通量测序相结合的方法,应用于临床耐药细菌的检测,达到同时获得菌株鉴定结果、耐药基因型及用于MLST分型的管家基因序列的目的,节约临床诊断的时间,综合分析本地区耐药基因的分布情况,为临床合理用药和进行流行病学监测提供科学依据。方法参考相关文献,选取大肠埃希菌常见的52种耐药基因,Genbank上下载耐药基因序列、大肠埃希菌16S r RNA基因序列及8个管家基因序列,序列交由美国Agilent公司设计合成适配于高通量测序仪的Sureselect目标捕获试剂盒。对临床收集的4株产ESBLs大肠埃希菌进行检测,建立目标捕获-高通量测序方法,并验证该方法的准确性和可重复性。应用目标捕获-高通量测序方法检测临床收集的22株产ESBLs大肠埃希菌,检测结果经BLAST比对,获得检测菌株的耐药基因型,结合药敏试验结果分析本地区大肠埃希菌的耐药特点;获得管家基因序列,使用Pasture软件进行MLST分型,分析菌株之间的流行病学关系。结果(1)运用我们建立的目标捕获-高通量测序方法检测临床收集的4株产ESBLs大肠埃希菌,得到的16S r RNA基因序列经BLAST比对后证实为大肠埃希菌,与VITEK-2检测系统鉴定结果相一致。选取部分耐药基因采用PCRSanger测序,两者测序结果完全一致。运用该方法重复检测这4株菌株,两次得到的结果一致。(2)临床收集产ESBLs大肠埃希菌22株,运用所建立的目标捕获-高通量测序方法进行检测,得到的16S r RNA基因序列经BLAST比对后证实所有菌株为大肠埃希菌,与VITEK-2检测系统鉴定结果相一致。(3)得到的耐药基因序列经BLAST比对,共得到24种耐药基因型。有20株检出8种ESBLs基因,其中CTX-M-14、CTX-M-55、CTX-M-15、CTX-M-27、CTX-M-65、SHV-12、OXA-1、OXA-10型的检出率分别为68.18%、45.45%、13.64%、4.55%、9.09%、18.18%、4.55%和4.55%。有3株检出Amp C类耐药基因,均为DHA-1型。有20株检出6种氨基糖苷类药物耐药基因,其中aac(3)-II、aac(6’)-Ib、ant(3’’)-I、aph(3’)-I、aad A、rmt B型的检出率分别为63.63%、18.18%、13.64%、9.09%、31.82%和4.55%。有17株检出6种喹诺酮类药物耐药基因,其中gyr A、gyr B、qnr B、qnr S、aac(6’)-Ib-cr、qep A型的检出率分别为45.45%、4.55%、4.55%、9.09%、36.36%和22.73%。有18株检出2种四环素类耐药基因,其中tet(A)和tet(B)型的检出率分别为68.18%、45.45%。TEM-1型基因检出率为90.91%,其他耐药基因均未检出。所有菌株均检出三种及以上不同种类药物耐药基因。药敏结果显示所有菌株对第三代头孢菌素类药物耐药严重,多重耐药株在50%以上。(4)得到的管家基因序列使用Pasture软件进行MLST分型,共得到16种不同的ST型,检出率最高的是ST38型,共检出3株,其他还有ST131型、ST405型等。结论(1)成功构建了可同时完成菌株鉴定、耐药基因检测及流行病学分型的目标捕获-高通量测序方法,证明了该方法有很好的准确性和可重复性,初步证实该方法可应用于临床耐药菌的检测,给临床快速诊断和用药提供一定的科学依据。(2)产ESBLs大肠埃希菌耐药情况严峻,耐药基因检出率高。与β-内酰胺类相关的耐药基因主要为TEM-1型和CTX-M-14型,与氨基糖苷类药物耐药相关的主要为aac(3)-II型和aad A型,与喹诺酮类药物耐药相关的主要为gyr A型与aac(6’)-Ib-cr型,与四环素类药物耐药相关的主要为tet(A)型和tet(B)型。(3)本研究中产ESBLs大肠埃希菌遗传背景具有多样性,ST38型为主要流行ST型,ICU内有交叉感染的可能,需加强监测。