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目的:观察血吸虫感染能否体内激活肝星状细胞(HSC)内的NLRP3炎症小体。方法:1)制定分组:正常对照组、血吸虫感染组以及YVAD(caspase-1活性抑制剂)治疗组,其中YVAD治疗组给予YVAD腹腔注射(剂量为:1mg/kg/24h);常规饲养6周后,利用HE和Masson染色观察肝组织损伤及纤维化的情况。2)利用免疫组化(immunohistochemistry)方法检测肝脏组织中白介素1β(IL-1β)的表达情况;同时,比较正常对照组、血吸虫感染组以及YVAD治疗组之间的差异。3)利用激光共聚焦方法检测肝脏组织中IL-1β和desmin(HSC的标记蛋白)的聚集情况;同时,比较正常对照组、血吸虫感染组以及YVAD治疗组之间的差异。结果:1)常规饲养6周之后,取小鼠的肝脏组织切片进行HE及Masson染色。结果显示:感染组小鼠肝脏组织结构遭到破坏,门静脉内可见沉积的血吸虫虫卵,出现以血吸虫虫卵为中心的嗜酸性肉芽肿,其周围有大量的胶原纤维沉积及炎症细胞浸润;然而,正常对照组小鼠的肝脏组织结构正常,未见以上变化;caspase-1活性抑制剂YVAD处理后,可发现血吸虫感染引起的肝脏损伤及纤维化程度得到明显减轻。2)免疫组化检测肝脏组织内的IL-1β的表达情况:感染血吸虫的小鼠肝脏组织内可见IL-1β的大量表达,表明血吸虫感染引起了肝脏中NLRP3炎症小体的激活,与正常组小鼠有显著性差异(P<0.05);YVAD治疗可以明显减少血吸虫虫卵周围的IL-1β表达。3)激光共聚焦方法检测肝脏组织内IL-1β和desmin(HSC的标记蛋白)的聚集情况:desmin作为HSC的标记蛋白,IL-1β表达升高作为NLRP3炎症小体的激活标志,两者的聚集升高表示HSC内NLRP3炎症小体的激活。血吸虫感染可以体内激活小鼠HSC内的NLRP3炎症小体,YVAD可以明显减少HSC内的IL-1β表达。结论:日本血吸虫感染可以激活小鼠HSC内的NLRP3炎症小体,caspase-1抑制剂YVAD可以抑制HSC内的NLRP3炎症小体激活,同时,可以明显减轻血吸虫感染引起的肝脏损伤及纤维化程度。目的:观察血吸虫虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)对小鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)内NLRP3炎症小体激活的作用研究。方法:1)利用正常对照组小鼠,提取小鼠原代肝星状细胞。2)体外SEA(50μg/ml)分别刺激HSC 12h、24h、48h后,激光共聚焦方法检测HSC内NLRP3与ASC、caspase-1的聚集情况;Western-blot方法检测HSC内Pro-caspase-1和active caspase-1的蛋白表达量的变化;同时,检测HSC内caspase-1活性以及细胞上清液中IL-1β的水平变化。3)利用Nlrp3 shRNA转染HSC抑制NLRP3表达,体外SEA作用HSC 24h后,激光共聚焦方法检测HSC内NLRP3与ASC、caspase-1的聚集情况;Western-blot方法检测HSC内Pro-caspase-1和active caspase-1的蛋白表达量的变化;同时,检测HSC内caspase-1活性以及细胞上清液中IL-1β的水平变化。4)利用 caspase-1 抑制剂 YVAD(10μg/ml)抑制 HSC 内 caspase-1 的活性,体外 SEA作用 HSC 24h 后,Western-blot 方法检测 HSC 内 Pro-caspase-1 和 active caspase-1的蛋白表达量的变化;同时,检测HSC内caspase-1活性以及细胞上清液中IL-1β的水平变化。结果:1)研究发现不同的作用时间下(12h、24h、48h),当SEA体外刺激HSC 24h后,可以明显诱导HSC内NLRP3与ASC、caspase-1的相互聚集;HSC内active caspase-1的蛋白表达量明显升高,而Pro-caspase-1的表达量无明显变化;同时,SEA刺激可以增加HSC内caspase-1活性以及细胞培养液中的IL-1β水平。2)Nlrp3 shRNA抑制HSC内的NLRP3基因后,可以明显降低SEA诱导的HSC内的 NLRP3 与 ASC、caspae-1 的相互聚集、active caspase-1 的蛋白表达量、caspase-1活性以及HSC培养液内的IL-1β水平,均具有统计学差异(P<0.05)。3)Caspase-1抑制剂YVAD抑制HSC内的caspase-1活性后,同样可以明显降低SEA诱导的HSC内active caspase-1的蛋白表达量、caspase-1活性以及HSC培养液内的IL-1β水平。结论:血吸虫虫卵抗原(SEA)可以体外激活肝星状细胞(HSC)内的NLRP3炎症小体。目的:观察血吸虫虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)对小鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)内NLRP3炎症小体激活的机制研究。方法:1)利用cathepsinB抑制剂Ca-074Me(5μM)、钾离子通路阻断剂glibenclamide(Glib,10μM)以及 ROS 清除剂 N-acetyl-L-cysteine(NAC,10μM)分别用来抑制 HSC 内的cathepsinB活性、钾离子通路、ROS通路,血吸虫虫卵抗原(SEA)作用HSC 24h,激光共聚焦方法检测HSC内NLRP3与ASC、caspase-1的聚集情况;蛋白免疫印迹方法检测HSC内pro-caspase-1和activecaspase-1的蛋白表达量的变化;同时,检测HSC内caspase-1活性以及细胞上清液中IL-1β的水平变化。2)利用NADPH氧化酶抑制剂gp-91pep(20μM)抑制HSC内的NADPH氧化酶后,观察SEA对HSC内的active caspase-1蛋白表达及IL-1β产量的影响。3)利用cathepsin B siRNA转染抑制HSC内cathepsin B的表达后,观察血吸虫虫卵抗原(SEA)对HSC内的NLRP3炎症小体聚集、激活的影响。4)利用siRNA转染技术将CathsiRNA转染至HSC内,抑制cathepsin B表达后,观察SEA对HSC内的溶酶体膜渗透性、cathepsinB释放及活性的影响;同时,利用cathepsinB抑制剂Ca-074Me(5μM)抑制HSC内的cathepsinB活性后,观察SEA对HSC内cathepsinB活性的影响。5)使用溶酶体膜稳定剂 dexamethasone(Dex,100μM)及 chloroquine(CQ,20μM)保护溶酶体膜后,观察SEA刺激能否继续诱导HSC内升高的active caspase-1蛋白表达量以及IL-1β产量。结果:1)激光共聚焦结果显示cathepsin B抑制剂Ca-074Me以及ROS清除剂NAC均可抑制SEA诱导的HSC内NLRP3与ASC、caspase-1的相互聚集,说明可抑制HSC内NLRP3炎症小体复合物的形成。同时,抑制HSC内cathepsinB活性及清除ROS亦可减低SEA诱导的HSC内active caspase-1蛋白量、caspase-1活性以及IL-1β产量。然而钾离子通路抑制剂Glib对SEA诱导的HSC内NLRP3炎症小体的形成和激活没有作用。2)通过使用NADPH氧化酶抑制剂gp-91pep抑制HSC内的NADPH氧化酶后,SEA诱导的HSC内active caspase-1蛋白表达量以及IL-1β产量明显降低,说明NADPH氧化酶在SEA诱导的HSC内NLRP3炎症小体的激活过程中发挥重要作用。3)利用siRNA转染技术将CathsiRNA转染至HSC内抑制cathepsin B表达后,可明显抑制SEA诱导的HSC内NLRP3炎症小体的形成与激活。4)SEA刺激可引起HSC内溶酶体膜渗透性增加,进而引起溶酶体内的cathepsinB转移至胞浆内,cathepsin B siRNA转染对SEA诱导的溶酶体膜渗透性增加没有影响,然而cathepsin B siRNA转染可以明显减低HSC内cathepsin B的蛋白表达;同时,SEA刺激可升高HSC内cathepsin B活性,cathepsin B siRNA转染或者使用cathepsin B抑制剂Ca-074Me均可明显抑制SEA诱导增加的cathepsin B活性。5)使用溶酶体膜稳定剂dexamethasone、chloroquine保护溶酶体膜后,可以明显抑制SEA诱导的HSC内升高的active caspase-1表达量以及细胞上清液中的IL-1β水平。结论:血吸虫虫卵抗原(SEA)诱导的HSC内NLRP3炎症小体的激活与氧化应激调节(ROS通路)、溶酶体膜渗透性升高及随后的cathepsinB释放、活性增加有关,但与钾离子通道激活无关。