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研究背景:原发性肝癌起病隐匿,恶性程度高,尤其是中晚期确诊的患者,多为不可切除性肝癌,现有系统性治疗药物疗效局限,难以显著改善患者临床结局。因此,亟需探索新型肝癌药物治疗策略。mi RNA失调是肝癌发生发展的重要机制。mi RNA替代疗法可改善肝癌内mi RNA表达谱,已成为新兴的肝癌治疗策略,但受限于mi RNA的不稳定性和脱靶效应,实际治疗效果不佳。纳米药物输送体系是近年来肿瘤治疗研究的热点之一,开发新型mi RNA载体、实现体内靶向递送和精准控释,有望解决mi RNA应用难题。mi RNA通过复杂交错的信号调节网络调控肿瘤生物学过程,探索mi RNA之间的协同作用、实现联合用药也是肝癌治疗的重要策略之一。研究目的:本研究通过合成新型p H响应性聚阳离子纳米材料,改善肝癌的mi RNA体内递送。利用该纳米载体,探究mi R-199a/b-3p mimics(mi R199)和antisense-mi R-10b(antimi R10b)在抗肝癌治疗中的协同作用(mi R-cocktail),并实现基于个体mi RNA表达谱的mi RNA鸡尾酒替代治疗。研究方法:第一部分:本研究采用聚乙烯亚胺交联环糊精(PEI-βCD)作为基因载体核心主体,将弱酸p H响应性的CDM(Dlinkm)作为中间键连接PEG和金刚烷胺形成三嵌段客体结构,通过环糊精和金刚烷基团之间共价结合发生主客体自组装,合成新型mi RNA递送载体PEI-βCD@Ad-CDM-PEG(PCACP),通过1H NMR表征化合物结构。PCACP包封mi R199后形成纳米粒,进行粒径、表面ζ电位、电镜观察、p H响应性、药物释放特性、细胞摄取和转染效率等性质表征。然后以人源Huh-7肝癌细胞株和Huh-7裸鼠肿瘤模型为对象,验证PCACP/mi R199系统的体外和体内抑瘤能力,治疗后细胞或肿瘤通过q RT-PCR对mi R-199a/b-3p表达水平进行定量、Western blot和免疫组化对mi R-199a/b-3p靶标蛋白表达量进行测定。第二部分:本文以PCACP为载体介导mi RNA递送。采用CCK-8法进行mi R199和antimi R10b体外肝癌细胞活力抑制实验并计算药物合用指数(CI)。在人源Huh-7肝癌细胞株和Huh-7裸鼠肿瘤模型上予以PCACP/mi R-cocktail治疗,证实mi R199和antimi R10b在肝癌增殖和转移中的协同增效作用,q RT-PCR对治疗后相关mi RNA表达进行定量,利用Western blot、免疫组化、Transwell实验等验证协同作用及其分子机制。建立PDX模型,根据原代肿瘤标本和癌旁组织进行mi RNA表达谱测序,针对个体mi RNA表达特征,在PDX荷瘤裸鼠上给予失调mi RNA协同调整治疗,通过肿瘤生长曲线、AFP水平检测判断治疗效果,Western blot和组织mi RNA测序揭示抑瘤机制。研究结果:第一部分:合成的PCACP载体可与mi R199在水中自组装形成纳米粒,在N/P=3时即可完全绑定mi RNA。纳米粒水合粒径为147.4±0.90 nm,表面ζ电位为19.83±1.36 m V,在p H 6.5弱酸刺激下CDM键断裂,脱去PEG外壳,粒径缩小至42.45±0.32 nm,而在中性溶液中保持结构稳定。在弱酸环境中mi RNA释放速率显著加快,半衰期为4.2 h、载药最大释放百分比达85.65%。激光共聚焦显微镜和流式细胞术显示,p H 6.5预处理后的纳米粒内吞作用和转染效率明显增强。活体荧光实时成像证实了PCACP/mi RNA体系的肿瘤靶向和聚集作用。体外和体内实验证明,肿瘤微环境酸刺激后的PCACP/mi R199系统可有效调控肝癌细胞内mi R-199a/b-3p表达水平,并通过调节m TOR/AKT及PAK4/Raf/MEK/ERK通路,抑制肿瘤增殖和分化能力,发挥抗肿瘤作用。第二部分:PCACP递送mi R199和antimi R10b抑制肝癌的IC50为2.66μg/m L,CI=0.26,存在协同增效作用。Huh-7细胞和移植瘤模型证明PCACP/mi R-cocktail可有效调节肿瘤内mi R-199a/b-3p和mi R-10b表达水平,并通过多条信号通路调节肿瘤增殖或侵袭相关蛋白如E-cadherin、vimentin、RHOC、p-m TOR和p-AKT等的表达,对PAK4/Raf/MEK/ERK通路的抑制作用也进一步加强,发挥协同抑制肿瘤生长的作用。Transwell和细胞划痕实验证实PCACP/mi R-cocktail可协同抑制肝癌细胞侵袭和转移能力。临床标本mi RNA表达谱测序,构建人源异种肿瘤移植模型(PDX),并基于microarray调配个体化mi R-cocktail治疗方案,由PCACP体内输送,证实其抗肝癌作用。结论:本研究合成了一种具有p H敏感性、粒径可变性、高效转染能力的主客体自组装聚阳离子纳米材料PCACP,作为递送mi RNA的载体。在肿瘤微环境弱酸性刺激下,p H响应的CDM键断裂造成PEG外壳脱落降解、粒径缩小,促进肿瘤部位mi RNA积聚和转染。本研究通过体外和体内实验证实,PCACP携带mi R199和antimi R10b两药联用通过多条信号通路起到协同抗肿瘤的作用。在PDX模型中,进一步证实个体化PCACP/mi R-cocktail疗法的抑瘤效果。