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【研究背景】肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病率在所有恶性肿瘤中居第四位,病死率居第三位。HCC发病隐匿,早期往往没有症状,很多患者在首诊时已经进入中晚期,失去了根治性治疗的机会。由于HCC高度的异质性,较其他实体肿瘤更易发生转移、复发及产生耐药。因此寻找肝癌发生发展过程中的有效分子标志物以及探究其在复发转移过程中的分子机制显得尤为重要。核富集转录因子1(Nuclear enriched abundant transcript 1,NEAT1)是最近发现的一种核限制性长链非编码RNA(Long noncoding RNAs,lnc RNA),它定位于亚核结构,被称为核旁斑,它的表达受到许多活化的炎症小体的刺激,主要通过MAPK途径调节细胞因子和趋化因子的表达,包括白介素6(IL-6)和趋化因子10(CXCL10),参与肿瘤免疫应答,进而调控肿瘤的免疫效应和促进肿瘤的发生。NEAT1作为促癌基因已经被报道参与众多肿瘤的发生与发展,其中包括肺癌,结直肠癌,胃癌,食管癌等。竞争内源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)机制是lnc RNA发挥调控作用的重要机制之一,部分lnc RNA和m RNA具有miRNA应答元件(miRNA response element,MRE),其可以作为分子海绵吸附miRNA。由于NEAT1作为ceRNA在肝癌发展过程中的作用尚未深入研究,这里将继续探讨其作为ceRNA在肝癌发展及转移中的作用。【目的】本研究旨在探索下列问题:1、筛选可能与NEAT1相互结合的miRNA,明确NEAT1是否具有ceRNA特性;2、检测NEAT1、miR-148a-3p在肝癌样本中的表达水平,分析其与临床病理特征及预后的关系;3、体内外实验RREB1/NEAT1/miR-1247-5p轴在肝癌细胞的增殖作用,探究其在EMT及肺转移的作用机制。【研究方法】1、NEAT1特性的验证:通过TCGA数据库中肝癌miRNA数据,并利用在线软件cbioportal进行分析,以log2FC>1,P adj(校正后p值)<0.05作为纳入标准,筛选显著低表达的miRNA;使用Star Base数据库预测出能与NEAT1有潜在相互作用的miRNA,将TCGA获得的数据以及Star Base预测的数据进行交集,获得最终研究的miRNA;利用Target Scan 7.2、Lnc Base v.2、miRDB在线数据库,预测其潜在的靶基因,并利用Go EAST及DAVID在线软件分析靶基因生物学功能;构建过表达及敲低NEAT1的细胞系,q RT-PCR验证miRNA表达的变化情况,双荧光素酶报告基因实验进一步验证NEAT1与筛选miRNA的结合情况。2、NEAT1/miR-148a-3p调控轴的验证:q RT-PCR分析肝癌及癌旁中NEAT1和miR-148a-3p的表达情况;FISH实验检测组织芯片中以及细胞系中NEAT1、miR-148a-3p的表达情况;Kaplan-Meier法分析NEAT1、miR-148a-3p的表达与肝癌患者预后的关系;卡方检验分析NEAT1、miR-148a-3p与肝癌患者临床病理特征之间的关系;ROC曲线分析NEAT1、miR-148a-3p对于肝癌的诊断价值;Ed U实验、wound healing实验、Transwell实验,分别验证NEAT1/miR-148a-3p轴对于肝癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力的影响。3、RREB1/NEAT1/miR-1247-5p调控轴的验证:利用GEPIA数据库验证RREB1与NEAT1表达相关性,利用q RT-PCR数据,进行Pearson相关系数,进一步分析肝癌组织中RREB1、NEAT1、miR-1247-5p三者之间的相关性;利用JASPAR数据库验证RREB1可以结合NEAT1的启动子区域;利用Western Blot、q RT-PCR实验分析改变RREB1和NEAT1后,EMT标志蛋白的蛋白水平及m RNA水平变化;免疫组化分析EMT标志蛋白的变化情况,HE染色分析肺转移情况。【研究结果】1、双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-148a-3p、miR-1247-5p、miR-511-3p均能明显降低荧光素酶活性表达值,表明NEAT1可以绑定miR-148a-3p、miR-1247-5p、miR-511-3p,说明NEAT1可能具有ceRNA的特性。2、根据肝癌临床组织样本分析发现,NEAT1在肝癌中高表达,而miR-148a-3p在肝癌中低表达,NEAT1高表达和miR-148a-3p低表达的患者其OS明显较差,二者均可作为评估肝癌预后的指标。3、体内外实验结果发现,过表达miR-148a-3p可以抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,而且由于过表达NEAT1而引起的肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭行为可以部分被miR-148a-3p所抑制。同时,体内外实验还验证了RREB1可以结合NEAT1基因的启动子区域,敲低RREB1后,NEAT1的表达水平下降,miR-1247-5p表达水平升高,E-cadherin表达水平升高,N-cadherin、Vimentin、Twist表达水平下降,同时肺转移瘤减少,敲低RREB1的生物学效应可以被过表达NEAT1所抑制,RREB1/NEAT1/miR-1247-5p轴调控肝癌细胞上皮间质转化及肺转移。【研究结论】1、NEAT1具有ceRNA特性,能够吸附多种相关的miRNA,形成ceRNA调控网络,并促进肝癌的增殖、侵袭和迁移能力,NEAT1可以成为肝癌治疗的潜在靶点。2、NEAT1和miR-148a-3p的表达水平是影响肝癌患者OS和DFS的重要因素,NEAT1高表达是一个危险性因素,而miR-148a-3p高表达则是一个保护性因素,同时NEAT1高表达也是影响肝癌患者OS和DFS的独立危险因素;NEAT1和miR-148a-3p的表达均对肝癌诊断有一定意义,与miR-148a-3p相比,NEAT1能好地诊断肝癌。3、NEAT1/miR-148a-3p轴能够调控肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,该调控轴可能成为肝癌治疗的联合治疗靶点。4、RREB1/NEAT1/miR-1247-5p轴能够调控肝癌细胞上皮间质转化以及肺转移,同时RREB1和NEAT1能够构成正向反馈环促进肝癌细胞上皮间质转换以及肺转移,该调控轴可能成为肝癌肺转移的治疗靶点。