目的:代谢组学技术的兴起和发展为中药复方现代化提供了新的研究思路,将代谢组学技术应用于中药复方机制探讨方面具备广阔前景。中药复方是中医理论与中药科学结合的产物,也是连接基础研究与临床实践的桥梁。桂枝汤源于东汉,被誉为“众方之祖”、“群方之魁”,主治太阳中风表虚证,至此经历了无数临床诊疗的检验,无论是单方或其加减方,仍广泛应用于临床。然而,当前对于桂枝汤的解热作用研究,大多从细胞因子IL-1,TNF-α以及中枢发热介质cAMP、PGE2等单方面进行阐述解释,均不能全面反映出药物对机体的调节过程,而且对桂枝汤中药物的配伍机制研究同样为数不多,因此,为进一步了解桂枝汤的作用机制,首先在药效学实验的基础上,对桂枝汤及其单味药的解热作用进行评价,再利用代谢组学技术进一步寻找桂枝汤及其单味药与发热相关的差异代谢小分子及相关代谢通路,并通过模块化分析获得关键靶点。以代谢产物为切入点,探讨桂枝汤解热的配伍及分子作用机制,为进一步阐明桂枝汤的作用机制提供新的研究思路。实验方法:1.桂枝汤及其单味药的解热作用药效学研究将64只SD大鼠随机分为8组(空白组、模型组、桂枝汤组、桂枝组、白芍组、生姜组、甘草组和大枣组),每组8只,进行正式实验前连续2天灌胃给药,空白组与模型组给予同等体积蒸馏水。实验前测量每组大鼠基础体温,通过背部注射酵母混悬液复制大鼠酵母致热模型,空白组注射相同体积生理盐水,造模成功后(体温升高超过0.8℃),各组大鼠分别给药一次,1h后重复给药一次,于造模4h、5h、6h、7h、8h后测量并记录大鼠体温变化情况,并通过SPSS 23.0统计软件对各组大鼠体温数据进行分析。2.桂枝汤及其单味药的代谢组学研究于药效学实验结束后,通过腹主动脉取血,静置离心后获得各组血清样本,选择GC-MS技术进行代谢物检测,检测前去除血清样本中的蛋白及其它杂质,并衍生化。利用 GC-MSsolution version 2.5(SHIMADZU Corporation)对原始图谱进行积分,通过NIST数据库及其他自建库对所检测的代谢物进行推测及鉴定,同时利用HMDB及KEGG数据库中进行检索和确认内源性代谢物。运用Metaboanalyst 4.0软件进行数据分析,分别将各给药组与空白组和模型组进行模式识别分析,其中包括PCA、PLS-DA以及聚类分析,比较其差异及分离情况;在PLS-DA分析基础上,获得各给药组大鼠与模型组大鼠血清代谢物的VIP值表,根据VIP值大于1和手动积分计算筛选出各给药组与模型组之间的差异代谢物,并通过MetPA插件进行通路分析,选择Impact值大于0.10的代谢通路,表示该通路可能与潜在的靶标路径紧密相关;运用Cytoscape中MetScape插件对每组差异代谢物进行网络模块化分析,并以平均节点度值为阈值筛选相关靶点。结果:1.桂枝汤及其单味药的解热作用药效学实验结果空白组大鼠温度以基础温度为准小范围上下波动,与空白组相比,模型组大鼠于造模4h后体温显著升高(P<0.01)。在造模5h后的各时间点,桂枝汤组大鼠体温均低于模型组大鼠体温,并于造模6h和7h后出现显著性差异(P<0.05);从体温变化趋势上来看,桂枝组大鼠经给药后,于造模6h后体温有一定下调趋势,但与模型组无显著性差异;白芍组大鼠经给药后,于造模5h后体温有所下调,但与模型组相比同样无显著性差异;大枣组大鼠各检测时间点的体温均较模型组大鼠体温低,且具显著性差异(P<0.05或P<0.01);生姜组及甘草组大鼠体温并无明显下调趋势。2.桂枝汤及其单味药的代谢组学研究结果根据PCA、PLS-DA的2D、3D图可知,桂枝汤组、桂枝组、白芍组、甘草组以及大枣组的各样本点均能与空白组和模型组分离,聚类分析结果显示,各给药组均能与空白组和模型组分离,且组内有一定的聚集趋势,证明以上各给药组与模型组具有一定的差异。而生姜组在三种模式下均无法与模型组分离,二者没有显示出明显差异,因此不进行下一步分析。基于模式识别分析,共获得13个模型组与空白组的差异代谢物,分别为L-Lactic acid(L-乳酸)、Glycerol(甘油)、Palmitic acid(棕榈酸)、Linoleic acid(亚油酸)、D-Glucose(D-葡萄糖)、L-Serine(L-丝氨酸)、Stearic acid(硬脂酸)、Oxalic acid(草酸)、L-Aspartic acid(L-天冬氨酸)、Cholesterol(胆固醇)、Urea(尿素)、Arachidonic acid(花生四烯酸)、L-Threonine(L-苏氨酸);桂枝汤组与模型组相比,共获得9个差异代谢物,分别为Stearic acid、L-Lactic acid、Glycerol、Palmitic acid、Linoleic acid、D-Glucose、Urea、Arachidonicacid、L-Threonine;桂枝组与模型组相比,共获得5个差异代谢物,分别为Arachidonic acid、Palmitic acid、Linoleic acid、Stearic acid、Cholesterol;白芍组与模型组相比,共获得 7 个差异代谢物,分别为 L-Lactic acid、Palmitic acid、Linoleic acid、L-Serine、Oxalic acid、Urea、Arachidonic acid;甘草组与模型组相比,共获得 5个差异代谢物,分别为 L-Lactic acid、Palmitic acid、D-Glucose、Urea、Arachidonic acid;大枣组与模型组相比,共获得6个差异代谢物,分别为L-Lactic acid、Palmitic acid、D-Glucose、L-Serine、Oxalic acid、L-Threonine。分别利用各给药组与模型组比较所得的差异代谢物进行通路分析发现:与桂枝汤解热相关的的通路共4条,分别为亚油酸代谢通路、花生四烯酸代谢通路、淀粉和蔗糖代谢通路以及甘油酯代谢通路;与桂枝解热相关的通路共2条,分别为亚油酸代谢通路和花生四烯酸代谢通路;与白芍解热相关的通路共4条,分别亚油酸代谢通路、花生四烯酸代谢通路、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸的代谢通路和氨酰基-tRNA的生物合成通路;与甘草解热相关的通路共2条,分别为淀粉和蔗糖代谢通路以及花生四烯酸代谢通路;与大枣解热相关的通路共3条,分别为淀粉和蔗糖代谢通路、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸的代谢通路以及氨酰基-tRNA的生物合成通路。通过模块化分析,筛选出各组相关靶点,与桂枝汤解热相关的靶点共有28个,其中26个属于细胞色素P450家族,其余两个靶点与糖酵解有关;桂枝、白芍、甘草与解热相关的靶点与桂枝汤细胞色素P450的26个靶点相同;与大枣解热相关的靶点共有14个,其中PPT1、PPT2为棕榈酰蛋白质硫酯酶,SHMT1、SHMT2为丝氨酸羟甲基转移酶,其余靶点均与糖类代谢有关。结论:从药效学结果来看,桂枝汤对干酵母所致的大鼠发热模型具有显著的降温作用,桂枝、白芍具有下调发热大鼠体温的趋势,甘草与生姜对干酵母致热模型大鼠无明显解热作用,大枣具有一定的解热作用,与其它组相比,更趋近于空白组,但从解热角度看来,与桂枝汤相比,大枣并无明显优势,表明桂枝汤的解热作用优于各单味药组。把各组同时与空白组比较,桂枝汤组样本与空白组样本的结果更接近,进一步证实了桂枝汤对发热大鼠体温解热效果最佳,说明在解热功效方面中药复方桂枝汤比其方中单味药更占优势。在此基础上,利用代谢组学技术探讨桂枝汤及其单味药的解热作用分子机制,发现桂枝汤对发热大鼠解热作用的机制主要与花生四烯酸代谢通路与淀粉和蔗糖代谢通路有关,主要作用靶点为细胞色素P450;桂枝、白芍、甘草的解热机制与花生四烯酸代谢通路相关,作用靶点与桂枝汤相同;另外,甘草与大枣的解热机制还与淀粉和蔗糖代谢通路相关。此外,桂枝汤与解热相关的主要通路与靶点涵盖了各单味药的主要通路与靶点,进一步证明,与单味药相比,桂枝汤在解热作用方面更具优势,且桂枝汤方中各个单味药具有一定的协同作用,具体作用机制仍需进一步研究。通过本实验的研究,在一定程度上,探究了桂枝汤及其单味药对干酵母所致大鼠发热模型的分子机制,从小分子代谢层面解释了桂枝汤解热的原因,为后续研究提供新思路。