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研究背景：糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是慢性肾脏病中最常见的继发性病因,也是引起终末期肾脏疾病(ESRD)的主要原因之一。肾小管细胞的氧化损伤和凋亡是DN早期的主要临床特征之一,其发病机制尚不完全清楚。近期研究证明：线粒体形态功能异常引起的线粒体动力学变化和线粒体ROS的过量产生在其中可能起着关键作用,且两者关系密切。衔接蛋白p66Shc是诱导细胞氧化应激和凋亡,以及调节生命周期的信号转导途径的重要分子。在高葡萄糖刺激下,p66Shc被激活并转位至线粒体,引起线粒体ROS过量产生并介导肾小管细胞的氧化损伤和凋亡。但在糖尿病环境中：DN患者的肾小管细胞是否发生线粒体动力学变化仍缺乏证据；线粒体片段化和线粒体ROS过度产生的因果关系尚不明确,以及p66Shc是否通过介导线粒体动力学变化这一新途径引起DN肾小管细胞氧化损伤和凋亡仍有待阐明。因此,本课题将围绕这三个具体问题展开研究。目的：观察DN患者肾组织中小管细胞的线粒体动力学变化和氧化损伤,及p66Shc和线粒体动力学调控蛋白的表达,从而寻找DN肾小管损伤的病因和机制。在体外实验中进一步研究在高葡萄糖刺激下线粒体片段化的分子机制及其和线粒体ROS过度产生的因果关系；并探讨p66Shc是否作为两者联系的枢纽,通过介导线粒体片段化进而导致肾小管上皮细胞氧化损伤和凋亡的机制。方法：1、选取DN和对照组微小病变患者各10例,常规HE、PAS和PASM染色观察两组肾活检组织中肾小球和肾小管的病理改变,应用电镜观察肾小管细胞线粒体超微形态结构变化,DHE染色检测肾组织中ROS水平,并通过免疫组化及免疫荧光方法检测两组肾组织中p66Shc蛋白,线粒体分裂蛋白Drp1和融合蛋白Mfn1的表达情况。2、体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,经Mito Red染色在共聚焦显微镜下观察不同浓度和时间葡萄糖刺激下的线粒体动力学变化,并行Western Blot检测Drp1和Mfn1的相应蛋白表达变化。应用mdivi-1抑制Drp1表达,免疫荧光显微镜检测低糖和高糖环境下HK-2细胞Drp1表达、线粒体动力学和线粒体ROS产生的变化。进一步通过转染p66Shc野生型或siRNA质粒,分析其对Drp1表达、线粒体动力学和ROS产生的影响和机制。结果：1、患者肾活检组织常规病理染色显示：与对照组微小病变患者比较,DN患者肾组织有明显结节性或弥漫性肾小球硬化,肾小管可见空泡变性和基底膜增厚,并有明显小管硬化和萎缩。电镜示DN患者肾小球较之对照组,基底膜增厚以及肾小管细胞线粒体形态结构出现显著片段化改变(P<0.05)；DHE染色显示DN患者肾组织ROS水平明显升高；免疫组化和免疫荧光检测证实：与对照组比较,p66Shc和Drp1蛋白表达明显升高,而Mfn1的表达降低(P<0.05)。2、在HK-2细胞中,线粒体形态在低糖环境下呈细丝状,而在高糖刺激下转变为短棒或颗粒状,且随刺激时间延长,出现线粒体片段化的细胞数显著增多(P<0.05),同时调控线粒体动力学的分裂蛋白Drp l和融合蛋白Mfn1在高糖刺激下的表达变化呈时间和剂量依赖性。用Drp1抑制剂ndivi-1干预后,高糖+：ndivi-1组比高糖组细胞的Drp1表达下降,发生线粒体片段化的细胞数量和细胞内线粒体ROS水平均明显降低(P<0.05)。进一步转染p66Shc质粒后显示：与低糖组比较,低糖+野生型p66Shc质粒组的细胞内Drp1表达升高,线粒体片段化增多,且线粒体ROS水平升高,而加入mdivi-1干预后,上述变化均有减弱；在高糖环境下,高糖+p66Shc siRNA组较之高糖+空质粒组,Drp1表达降低,线粒体片段化程度减轻,且线粒体ROS水平下降。这些提示p66Shc可通过影响Drp1的活性来介导线粒体动力学变化,进而引起线粒体ROS过量产生。结论：该研究首次在DN患者肾活检组织中证实了肾小管细胞发生线粒体片段化,伴随着线粒体动力学调控蛋白的表达变化和细胞内ROS的过量产生。并阐明了p66Shc可能通过影响Drp1来介导线粒体动力学变化这一新途径,从而引起线粒体ROS过量产生并最终导致DN肾小管细胞的氧化损伤和死亡。这为线粒体损伤在DN发病机制中的作用提供了新的分子机制和实验依据。