论文部分内容阅读
背景:原发性肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,我国为肝癌高发国,全球约有50%的新增病例和45%死亡病例均发生于中国。而原发性肝癌的致病机制目前尚不完全清楚。NQO1是一种定位细胞质的氧化还原酶,并在多种肿瘤组织中呈高表达。已有研究表明,NQO1在肝癌中呈高表达并和肿瘤转移,血管侵袭以及病人不良预后相关,但NQO1在肝细胞肝癌发生发展中的作用以及具体的分子机制目前尚不清楚,有待进一步研究。目的:研究NQO1在肝癌恶性增殖和凋亡过程中的重要作用并解析其机制。方法:1.利用基因芯片和公共数据库(GEO,Gene Expression Omnibus)的数据集,筛选在肝癌病人的肝癌组织及癌旁组织中表达具有显著性差异的基因。Western blot和免疫组织化学验证60例肝癌病人的肝癌组织及癌旁组织中的NQO1的蛋白表达水平以及细胞定位。使用公共数据库数据(TCGA,The Cancer Genome Atlas)数据集,分析肝癌病人NQO1表达水平与多个临床病理参数及肝癌病人生存率的相关性。Western blot和qRT-PCR检测多个肝癌细胞、永生化肝细胞MIHA、人原代肝细胞PHH和正常肝组织中NQO1的mRNA和蛋白水平。利用NQO1酶活性检测分析肝癌病人肝癌组织及肝癌细胞中NQO1的活性。2.在肝癌细胞中,利用慢病毒介导的shRNA技术敲低NQO1基因,并利用CRISPR/Cas9技术构建NQO1稳定敲除的细胞系。通过台盼蓝染色实验、Edu标记实验、平板集落实验和软琼脂实验检测NQO1基因敲低或基因敲除对肝癌细胞增殖的影响。分别采用流式细胞术和Western blot检测NQO1基因敲低对肝癌细胞凋亡的影响。3.在永生化的肝细胞MIHA上过表达NQO1,使用以上NQO1敲出检测中相同方法分析NQO1过表达对永生化肝细胞增殖和凋亡的影响。4.使用质谱分析在NQO1敲除肝癌细胞和对照肝癌细胞,从中筛选出表达具有显著差异的潜在凋亡信号通路分子。使用Western blot和qRT-PCR检测NQO1基因敲低或NQO1抑制剂对XIAP以及SIRT1-7家族成员的蛋白及mRNA水平的影响。使用Western blot和qRT-PCR分别检测SIRT1-7基因敲低对XIAP蛋白及mRNA水平的影响。5.分别用MG132、放线菌酮处理NQO1基因敲低的肝癌细胞,Western blot检测NQO1基因敲低对XIAP和SIRT6蛋白降解的影响。在NQO1基因敲低的肝癌细胞中分别过表达XIAP或SIRT6,分别用台盼蓝染色实验检测肝癌细胞增殖的变化,流式细胞术检测肝癌细胞凋亡的变化。CO-IP检测NQO1基因敲低对SIRT6泛素化水平的影响,SIRT6基因敲低对XIAP泛素化水平的影响,SIRT6与AKT的结合以及AKT的乙酰化水平。Western blot检测SIRT6基因敲低对AKT,p-AKT,p-XIAP 的影响。7.在裸鼠异位移植瘤中验证NQO1基因敲低对肝癌细胞生长增殖的影响。结果:1.在本研究中我们发现在肝癌病人中NQO1 mRNA水平,蛋白表达及酶活性明显增高,并且NQO1高表达与肝癌病人的肿瘤分期,血管侵袭以及低总生存率高度相关。NQO1在多个肝癌细胞系中的mRNA水平,蛋自表达水平及酶活性较原代肝细胞均显著增高。2.在肝癌细胞中,NQO1基因敲低或基因敲除明显抑制细胞的增殖,DNA合成,并抑制细胞的集落形成以及非锚定依赖生长;同时,NQO1基因敲低可以促进肝癌细胞的凋亡。3.NQO1过表达可以促进永生化肝细胞MIHA的细胞增殖,DNA合成和非锚定生长;NQO1过表达可以抵抗阿霉素诱导的永生化肝细胞凋亡。4.机制解析发现,NQO1基因敲低或基因敲除通过促进XIAP的降解,降低XIAP的蛋白水平,从而促进凋亡。具体机制是:NQO1基因敲低或敲除可以显著增加SIRT6的泛素化,从而促进SIRT6的蛋白酶体途径降解;SIRT6水平下降可引起下游蛋白激酶AKT乙酰化水平增加,从而降低AKT磷酸化,导致AKT酶活性下降;AKT失活可引起下游XIAP的磷酸化水平下降,导致其蛋白稳定性显著下降,最终引起XIAP蛋白水平的降低。5.XIAP过表达或SIRT6过表达均可逆转NQO1基因敲低对肝癌细胞生长的抑制作用以及对肝癌细胞凋亡的促进作用。6.在裸鼠异位移植瘤模型试验中发现NQO1基因敲低可以抑制移植瘤的生长。