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烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)为番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)幽影病毒属(Umbravirus)成员,与黄症病毒科(Luteoviridae)的烟草扭脉病毒(Tobacco vein distorting virus,TVDV)复合侵染引起烟草丛顶病。TBTV基因组是一条(+)ssRNA,由4 152个核苷酸组成,编码4个开放阅读框。ORF1编码35 kDa的蛋白,ORF1的C端与ORF2的N端有8个密码子的重叠,ORF1蛋白通过-1位的移码翻译机制表达产生RdRp,为ORF1/ORF2融合蛋白形式。在对云南多地采集的烟草丛顶病毒进化分析后发现,烟草丛顶病毒RdRp编码区序列一致率相对较低,推测RdRp的活性变化可能导致病毒致病力的变化。本研究旨在建立TBTV RdRp介导的体外复制体系,并初步定位参与复制调控的RNA元件。首先通过重叠PCR扩增得到烟草丛顶病毒中国分离物RdRp的编码序列。构建以pMAL-C2X为基础载体的原核表达载体pMAL-TB-RdRp。0.5 mM IPTG诱导可特异性表达分子量约为120 kDa的MBP-RdRp融合蛋白。不同温度条件下诱导MBP-RdRp,结果显示,相比26℃和37℃,18℃下诱导表达的MBP-RdRp融合蛋白的可溶性比例较高,约17%;经亲和层析纯化的MBP-RdRp可特异性识别TBTV正链和负链的3’末端序列,催化体外复制;并且对正负链的3’末端的体外复制效率存在差别,识别负链3’末端的体外复制效率明显高于正链3’末端。说明TBTV RdRp介导的特异性体外复制的建立。同时,结合RNA结构体外分析构建了3’UTR区的部分突变体,根据体外复制效率的变化初步定位了参与复制调控的RNA元件。同时,构建了不同分离物TB-JC,TB-MDI,TB-MDII的RdRp的原核表达载体,并初步验证了纯化的不同分离物RdRp的体外复制活性。为将来进行不同TBTV分离物RdRp的活性比较并定位关键氨基酸突变奠定了基础。