研究背景：急性肺损伤(acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫综合症（acuterespiratory distress syndrome, ARDS）是多种致病因素引起的全身炎症反应失控，炎症介质大量产生、释放，从而导致肺泡上皮、肺毛细血管内皮等发生广泛的、非特异性损伤的急性病理过程，进展快、死亡率高，目前尚无有效的防治药物。基因防治是ALI/ARDS很有前景的预防与治疗手段，但选择何种靶基因及如何实现靶基因的可控性表达是目前基因治疗尚未解决的两大难题。NF-κB过度活化是ALI炎症反应失控的关键环节。NF-κB能与多种炎症因子基因启动子区的κB位点特异性结合，促进基因转录和蛋白质合成；同时NF-κB也可以抑制肺内中性粒细胞凋亡，导致肺部炎症反应持续时间延长。因此，NF-κB是调控ALI炎症反应的重要干预靶点。细胞在静息状态下，胞浆中NF-κB与其抑制分子IκB结合，所以不能入核发挥作用；当细胞受到LPS等刺激时，IκB的32及36位丝氨酸位点发生磷酸化，进而被泛素化酶识别、降解，解除了对NF-κB的抑制，NF-κB进入细胞核发挥作用。因此，IκB磷酸化是NF-κB通路激活的关键，无法磷酸化的突变体IκBα（32及36位丝氨酸位点突变为丙氨酸）则可有效抑制NF-κB入核及NF-κB通路的活化。但是，NF-κB是具有重要生理功能的转录因子，过度抑制NF-κB活性可能对机体同样有害。因此，根据炎症反应的强弱调节NF-κB的活化水平、实现对ALI炎症反应强度的反馈性调节是本课题的重要目标。热休克蛋白70（HSP70）是细胞重要的应激反应蛋白之一。ALI时，失控的炎症反应可以引起细胞强烈的应激反应，诱导细胞HSP70的大量表达。研究表明，在一定剂量范围内，LPS引起机体炎症反应的强度和细胞HSP70的表达水平之间呈正相关。因此可以推测: LPS刺激引起的炎症反应强度与HSP70启动子活性可能存在正性相关，利用HSP70启动子驱动突变体IκB（即32和36位丝氨酸突变）的表达，可能实现根据炎症反应强弱反馈调节突变体IκB表达、进而反馈性调节NF-κB活性及其下游炎症因子表达水平，即机体炎症反应的负反馈调控的目的。研究目的与意义：1.研究目的（1）构建HSP70启动子驱动的IκB突变体基因治疗载体Phsp70/IκBαm。（2）通过体内实验检测Phsp70/IκBαm载体对LPS诱导的小鼠ALI的防治作用以及对不同剂量LPS诱导的ALI炎症反应的反应性。（3）在体外实验中，通过与强启动子CMV驱动的IκBα突变体载体进行比较，验证构建的Phsp70/IκBαm基因治疗载体能否实现根据炎症反应强弱反馈调节突变体IκBα表达，进而反馈性调节NF-κB活性及其下游炎症因子表达水平，即对机体炎症反应的负反馈调控的目的。2.研究意义通过体内、外实验，探索Phsp70/IκBαm基因治疗载体自控性、有效性抑制NF-κB活性进而调控机体炎症反应的可行性。克服强启动子驱动策略对组织细胞中NF-κB活性的过度抑制作用，最大限度减低基因防治的副作用。本课题在ALI基因治疗靶基因和可控性表达方面进行了有益的探索，将为ALI及其它炎症相关疾病的基因治疗提供新思路和线索。实验方法1.动物实验4~6周龄BALB/c小鼠（体重18g左右），适应环境2天后，随机分为四组：1）生理盐水（NS）对照组（n=5），给小鼠尾静脉注射NS，24h后气管内滴注NS；2）Phsp70/IκBαm对照组（n=5），先给小鼠尾静脉注射经活体转染试剂包被好的Phsp70/IκBαm质粒，24h后气管内滴注NS；3）LPS组，先给小鼠尾静脉注射NS，24h后气管内分别滴注不同浓度LPS，即0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg三个浓度组（n=5/组）；4）Phsp70/IκBαm/LPS组（n=5/组），先给小鼠尾静脉注射包被好的Phsp70/IκBαm质粒，24h后同样分为三个浓度组进行气管内滴注LPS。12h后收集肺脏、心脏和肝脏组织检测IκB和磷酸化NF-κB表达、炎症因子的变化，观察肺组织湿干比值、MPO活性和肺组织学病理变化。收集并检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中的蛋白含量、炎症因子。2.细胞实验将处于对数生长期A549和RAW264.7细胞无血清培养18h后，进行细胞瞬时转染。转染后24h分别以0.01μg/mL、0.1μg/mL和1μg/mL的LPS刺激细胞12h。为了确定HSP70启动子是否可以有效启动IκBαm表达并抑制磷酸化NF-κB的表达，且呈剂量依赖性量效关系。Phsp70/IκBαm载体瞬时转染巨噬细胞系RAW264.7和肺泡上皮细胞系A549细胞，48h后利用RT-PCR和Western-blot方法检测IκBαm mRNA和蛋白及磷酸化NF-κB蛋白表达变化。为了观察Phsp70/IκBαm载体对A549细胞的保护作用，Phsp70/IκBαm载体瞬时转染于A549细胞，48h后经LPS刺激12h，采用MTT方法检测细胞活力，收集培养上清，检测细胞损伤指标LDH活性。为了观察Phsp70/IκBαm载体对RAW264.7和A549细胞分泌炎症因子影响，Phsp70/IκBαm载体瞬时转染RAW264.7和A549细胞，48h后经LPS刺激12h，收集细胞上清培养液，采用ELISA方法检测细胞上清中炎症因子TNF-α和IL-6含量。实验结果1. Phsp70/IκBαm载体能够根据炎症反应的严重程度反馈调节LPS诱导的肺损伤通过检测肺损伤指标，观察Phsp70/IκBαm对小鼠ALI的治疗作用，结果显示：Phsp70/IκBαm对肺水肿有显著改善作用，可有效降低LPS刺激后小鼠肺湿干比值，不同浓度LPS刺激后湿干比的降低比率分别为3.1%、16.9和39.1%；Phsp70/IκBαm可以有效改善ALI肺组织的病理学改变，包括肺间质炎性细胞浸润减少，肺间质增厚、肺泡腔变窄、点片状出血、肺组织水肿和肺不张等现象均有减轻；Phsp70/IκBαm可以降低肺组织MPO活性和BALF中蛋白含量，抑制率分别为4.3%、23.5%、52.3%和0.1%、5.7%、18.3%。结果显示Phsp70/IκBαm的抑制率与LPS刺激剂量即炎症反应强弱呈正相关。2. Phsp70/IκBαm载体可呈LPS剂量依赖性反馈降低LPS诱导的炎症反应实验结果表明：小鼠体内转入Phsp70/IκBαm，肺组织内IκBα表达水平可显著升高；LPS刺激后，小鼠肺组织内磷酸化NF-κB活化水平呈LPS刺激浓度依赖性被抑制；BALF中炎症因子TNF-α、IL-6水平呈LPS浓度依赖性显著降低，抑制率分别为9.6%、29.2%、35.8%和13.0%、19.2%、37.7%。表明Phsp70/IκBαm载体可根据炎症反应的强弱反馈调节NF-κB活化水平及炎症因子表达水平。3. Phsp70/IκBαm载体可呈LPS剂量依赖性反馈降低LPS诱导细胞损伤和炎症反应通过体内实验证实Phsp70/IκBαm对肺部炎症及肺损伤的防治作用后，我们进一步通过体外实验探讨了Phsp70/IκBαm的有效性和可控性。结果显示：Phsp70/IκBαm分别瞬时转染A549和RAW264.7细胞48h后，IκBα表达显著升高，LPS刺激后IκBα表达呈LPS浓度依赖性显著升高；与空载体及阳性对照载体相比，Phsp70/IκBαm可有效抑制磷酸化NF-κB，且抑制作用呈LPS浓度依赖性。转染空载体组磷酸化NF-κB表达继续显著升高，而转染阳性对照载体后磷酸化NF-κB表达被显著抑制，但抑制效果无LPS浓度依赖趋势。细胞损伤指标检测结果表明：转染Phsp70/IκBαm后，A549细胞活力呈LPS浓度依赖性升高，不同浓度LPS刺激后细胞活力升高比率分别为0.8%、6.9%和12.5%。转染空载体后A549细胞活力明显降低，而转染阳性对照载体后A549细胞活力虽可改善，但效应和LPS浓度无关。LDH检测结果显示，转染Phsp70/IκBαm后，A549细胞LDH活性被抑制，抑制率分别为11.2%、14.3%和26.2%。转染空载体后，A549细胞LDH活性显著升高，细胞损伤严重。而转染阳性对照载体后，A549细胞LDH活性被强效抑制，但抑制效果与LPS浓度无关。ELISA方法检测结果显示，Phsp70/IκBαm可有效抑制LPS刺激后A549细胞TNF-α和IL-6的合成与分泌，抑制率为TNF-α分别被降低了5.5%、17.8%和24.4%，IL-6抑制率分别为0.5%、7.7%和20.8%。Phsp70/IκBαm对RAW264.7细胞TNF-α的抑制率为分别10.1%、27.5%和46.4%，对IL-6的抑制率分别为13.6.7%、27.6%和40.8%。转染空载体组炎症因子含量仍明显增加，转染阳性载体后，炎症因子被强效抑制，但抑制率与刺激程度不相关。结论1. Phsp70/IκBαm载体能够根据炎症反应的严重程度反馈调控突变体IκBα表达，进而抑制NF-κB活性及NF-κB下游炎症因子表达。2. Phsp70/IκBαm载体可呈剂量依赖性反馈抑制LPS诱导肺损伤时的炎症反应，并减轻小鼠肺损伤程度。3. Phsp70/IκBαm载体可呈剂量依赖性反馈抑制巨噬细胞和肺泡上皮细胞分泌炎症因子，并保护肺泡上皮细胞。