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研究背景残毁性掌踦角皮症(Vohwinkel syndrome,VS)是罕见的难治性遗传性皮肤病,依据不同的突变基因和临床表现,分为典型和变异型二型,病因及发病机制至今不清。已有研究证实GJB2基因突变可致典型残毁性掌跖角皮症,但国内外尚无相关功能学研究阐明其具体机制。随着近年来基因表达谱技术研究的飞速发展,基因表达芯片在筛选发现疾病相关基因、探索疾病的发生与发展、寻求精准治疗靶位点等方面,发挥着越来越重要的作用。为了更全面地了解残毁性掌跖角皮症中异常基因的表达的差异情况,本课题将在前期研究的基础上对该病已成功构建的细胞模型进行差异基因的筛选,从而更精准地发现和分析差异表达基因在疾病发生中的具体功能。目的本研究构建携带Tet-on系统调控的两种残毁性掌跖角皮症GJB2突变型基因(G130V、D66H)慢病毒载体转染永生化角质形成细胞(HaCaT)的稳定株。利用流式细胞仪检测细胞凋亡,运用人基因表达谱技术(Afffymetrix表达谱),研究GJB2基因突变体可能导致残毁性掌跖角皮症特殊临床症状的机制。方法(1)通过利用PCR技术扩增人GJB2基因突变型(G130V、D66H),克隆至以Tet-on系统调控的慢病毒质粒,并进行重组质粒鉴定与测序,获得质量符合标准的两种阳性慢病毒表达载体。(2)分别将两种阳性慢病毒转染至HaCaT细胞,经puromycin和DOX双筛后,分别培养两种稳定过表达GJB2基因突变型的HaCaT细胞株,并利用RT-PCR检测GJB2基因mRNA的表达情况。(3)利用流式细胞分析法分别检测过表达GJB2基因突变型(G130V、D66H)对HaCaT细胞凋亡的影响。(4)分别制作两种Affymet:rix表达谱芯片(G1 30Vvs.NC和D66H vs.NC),经数据分析后分别筛选出两种基因芯片的差异表达基因。同时结合IPA(Ingenuity Pathway Analysis)分析技术,深入对差异基因进行的生物信息学分析,筛选出人GJB2突变体差异表达基因且与残毁性掌跖角化症症状与发病机制密切相关的基因和信号通路,并针对候选基因利用RT-PCR技术进行实验验证。结果(1)成功构建稳定GJB2基因突变型D66H和G130V的HaCaT细胞株。(2)相比NC(对照组)组,两突变组提高了 HaCaT细胞的凋亡率,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)基因芯片结果数据筛查结果:与NC组相比,G130V组上调基因数为251个,下调基因数目为273个,D66H组上调基因数为1072个,下调基因数目为701个(P<0.05且差异均在1.5倍以上)。G130V vs.NC组中,根据基因芯片结果和IPA分析结果共筛选21个差异表达基因,RT-PCR验证结果与芯片预测一致。D66H vs.NC组中共筛选23个差异表达基因,RT-PCR验证发现除MAPK8等4个差异基因mRNA表达量与芯片结果预测相反,其他结果均与芯片预测一致。(4)分别检测两组中皮肤角化相关基因FLG和LOR mRNA表达量变化,相比NC组,两组FLG基因均上调,G130V组中LOR基因无显著变化,而D66H组中其表达量下调。(5)实验验证发现差异基因与AHR、IFN、JAK/STAT和JNK/AP1信号通路相关。并且,不同的GJB2基因突变型可能有不同的信号通路参与引起残毁性掌跖角皮症。结论(1)本课题发现JNK/AP1信号通路在不同的GJB2突变所致的残毁性掌跖角皮症中均参与调控。(2)GJB2基因不同的突变,可能存在不同信号传递参与异常致病。(3)不同GJB2突变中参与调控的上游网络存在差异,且对下游功能调控较为复杂。(4)本实验利用基因芯片技术结合传统实验室研究的方法,首次发现典型的残损性掌跖角皮症中多个异常差异基因,丰富了对相关的异常的信号传递通路的认知,为进一步研究致病机制奠定基础,并提供了更具体的研究方向和思路。