论文部分内容阅读
一、研究背景大量研究证实高血压合并糖尿病及高胰岛素血症的病人,发生心脑血管并发症的风险大大高于单纯高血压病人,动物实验与基础研究证实:1、胰岛素可诱发实验动物动脉硬化的发生;2、在超生理浓度下,胰岛素刺激血管平滑肌细胞的增生和迁移;3、长期给与外源胰岛素导致脂异常与动脉壁增厚;4、胰岛素输注加速了输注动脉的粥样硬化。提示胰岛素抵抗及其代偿性的高胰岛素血症是冠心病的重要危险因素,在冠心病和血管增生性疾病的预防和治疗过程中也说明高胰岛素血症在血管增生性病变中发生重要作用。积极改善胰岛素抵抗和高胰岛素血症,对以上的疾病将起到积极的防治作用。二、研究目的明确结构基因外修饰对血管平滑肌细胞增殖及表型转换的影响,找出胰岛素介导血管平滑肌细胞异常增殖时基因外改变(结构基因外修饰)调控细胞增殖的变化规律及结构基因外修饰和细胞增殖相关基因表达差异之间的内在联系及作用机制,揭示血管平滑肌细胞增殖的机制,为血管增生性疾病的防治寻求新的理论和实验依据。三、研究内容1.胰岛素促SHR VSMCs增殖的MAPK机制。2.丁酸钠阻断HDAC后组蛋白超乙酰化对SHR VSMCs增殖的影响。3.胰岛素对组蛋白乙酰化的影响,PD98059阻断MAPK通路后组蛋白乙酰化的改变。4.胰岛素对HDAC1的作用及PD98059阻断MAPK后对这种作用的影响。5.丁酸钠导致的组蛋白超乙酰化对MAPK通路的影响。6.胰岛素对增殖相关因子PDGF基因转录及蛋白表达的影响及PD98059和丁酸钠对胰岛素的这种作用的影响。7.胰岛素对VSMCs表型相关蛋白质α-SM actin、OPN表达的影响及PD98059和丁酸钠对其的作用。8.胰岛素、PD98059、丁酸钠对PDGF和α-SM actin DNA启动子甲基化的影响。四、研究方法1.原代培养SHR VSMCs。2. H3-TdR掺入、MTT法、细胞计数法、流式细胞仪检测VSMCs的增殖情况。3.建立胰岛素促VSMCs增殖的浓度曲线。4.以胰岛素及PD98059干预VSMC后观察VSMCs增殖的情况,免疫印迹和RT-PCR观察MAPK蛋白质表达及mRNA表达的变化。5.丁酸钠干预VSMCs后对胰岛素促VSMC增殖作用的影响。6.免疫印迹检测胰岛素、PD98059、丁酸钠对VSMCs HDAC1及组蛋白乙酰化的影响。7.免疫印迹检测胰岛素、PD98059、丁酸钠对MAPK表达的影响,RT-PCR检测其对MAPK基因转录的作用。8.免疫印迹检测胰岛素、PD98059、丁酸钠对PDGF和α-SM actin表达的影响,RT-PCR检测其对PDGF和α-SM actin基因转录的作用。9.特异性甲基化DNA PCR检测胰岛素、PD98059、丁酸钠对PDGF和α-SM actin DNA启动子甲基化的影响。五、研究结果1.胰岛素能够明显促进MAPK的表达及SHR VSMCs增殖,且这种作用能被PD98059阻断。2.丁酸钠能抑制胰岛素促进SHR VSMCs增殖的作用。3.胰岛素促进HDAC1的表达,丁酸钠明显抑制HDAC1的表达,PD98059对HDAC1的表达无明显影响。4.免疫印迹显示胰岛素促进组蛋白H3乙酰化,而PD98059抑制胰岛素的这种作用。5.胰岛素上调PDGF的表达,同时下调α-SM actin的表达。该作用可被PD98059和丁酸钠阻断。6.胰岛素促进MAPK、PDGF基因的转录,同时抑制α-SM actin基因的转录,该作用可被PD98059和丁酸钠阻断。7. PDGF DNA启动子在SHR VSMCs中生理情况下处于非甲基化状态,胰岛素、PD98059对其非甲基化状态没有影响,但丁酸钠可以使PDGF DNA启动子发生甲基化。8.α-SM actin DNA启动子在SHR VSMCs中生理情况下处于非甲基化状态,胰岛素、PD98059、丁酸钠对其非甲基化状态均没有产生影响。六、结论1.胰岛素介导SHR VSMCs增殖经由MAPK信号传导途径。2.组蛋白乙酰化的改变参与了胰岛素介导SHR VSMCs增殖的过程,且这种过程通过MAPK信号传导途径。3.胰岛素介导SHR VSMCs增殖没有α-SM actin及PDGF DNA启动子甲基化状态的改变参与,但丁酸钠抑制SHR VSMCs增殖可能涉及PDGF DNA启动子的甲基化改变。