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吸烟能够导致心血管系统结构和功能改变,是心血管疾病的独立危险因素。冠状动脉粥样硬化性心脏病是目前发展中国家最常见、最重要的引起死亡和致残的疾病之一。许多临床观察发现吸烟影响血脂代谢,但具体机制仍在探讨中,吸烟对巨噬细胞脂质转运功能的影响尚无报道。动脉粥样硬化的典型特征是巨噬细胞通过清道夫受体吞噬大量的脂质,过量胆固醇沉积于巨噬细胞,导致泡沫细胞形成。三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporters A1, ABCA1)和G1介导的胆固醇外流是胆固醇逆转运的始动过程,对维持巨噬细胞内脂质稳态发挥了重要作用。大量的研究证实,ABCA1介导的以apoA-1为接受体的细胞内胆固醇外流功能障碍能加速动脉粥样硬化的发生和发展。虽然目前的研究对ABCG1是否是动脉粥样硬化的保护性因素仍存在争议,但在巨噬细胞中,ABCG1介导的以HDL为接受体的胆固醇外流功能与ABCA1介导的胆固醇外流具有协同作用。因此,我们在建立荧光标记的胆固醇测定巨噬细胞胆固醇外流新方法的基础上,观察吸烟受试者巨噬细胞ABCA1和ABCG1介导胆固醇外流功能,探索吸烟、戒烟对巨噬细胞功能的影响和血脂代谢异常的机制。研究烟草中主要成分对巨噬细胞脂代谢的影响。研究目的1.建立以荧光蛋白标记的胆固醇(NBD-cholesterol,NBD-C)测定巨噬细胞胆固醇外流的新方法。2.分析吸烟受试者血脂水平,比较吸烟受试者戒烟前后血脂变化与平行对照组的差别。3.比较健康非吸烟受试者与健康吸烟和冠心病吸烟受试者巨噬细胞ABCA1和ABCG1的表达和功能。4.观察吸烟受试者戒烟前后巨噬细胞ABCA1和ABCG1的表达和功能变化。5.分析烟草中成分对体外培养的巨噬细胞的脂代谢影响,并初步探讨其机制。研究方法1.在原代人巨噬细胞和不同巨噬细胞细胞系中建立NBD-C测量细胞内胆固醇外流的新方法,并与金标准同位素标记的胆固醇3H-cholesterol相关联。2.在基线时收集受试者的静脉血,提取外周血单核细胞并诱导分化为巨噬细胞,观察健康不吸烟对照组、健康吸烟组和冠心病吸烟组人群巨噬细胞ABCA1和ABCG1的表达并测定其诱导细胞内胆固醇外流功能；记录受试者血脂水平；3.健康吸烟受试者和冠心病吸烟受试者被随机分为戒烟组,戒烟三个月,其他受试者继续按原有习惯吸烟三个月作为平行对照组。随访三个月后,提取外周血单核细胞诱导分化,比较巨噬细胞ABCA1和ABCG1的表达及功能变化,同时测定血脂水平；4.体外培养THP-1人单核巨噬细胞系,分别以尼古丁,一氧化碳干预细胞,观察它们对巨噬细胞的影响并初步探讨可能机制。研究结果1.在原代人巨噬细胞中,荧光标记胆固醇与同位素标记的胆固醇用于测定ABCA1和ABCG1介导的胆固醇外流有很好的相关性。荧光标记胆固醇可用于高通量巨噬细胞胆固醇外流率的测定；2.基线时,测定三组人群中血脂水平结果为：1) apoA-1:健康不吸烟者(1.501+0.064g／L)>健康吸烟者(1.338+0.044g／L)>冠心病吸烟者(1.349±0.043g／L)(p=0.022和p=0.048)；2) HDL-cholesterol:健康不吸烟者(1.389±0.065mmol/L)>健康吸烟者(1.167±0.053mmol/L)>冠心病吸烟者(1.098±0.051mmol/L)(p=0.008和p=0.0011；31TC和LDL-cholesterol在三组之间无显著差异；TG：健康不吸烟者(0.996±0.165mmol/L)<健康吸烟者(1.868±0.219mmol/L)(p=0.007)；apoB：健康不吸烟者(0.773+0.063g／L)<健康吸烟者(0.934+0.036g／L)(p=0.007)；3.吸烟受试者巨噬细胞ABCA1蛋白表达显著低于非吸烟受试者；CAD吸烟受试者巨噬细胞ABCA1表达显著低于健康吸烟受试者；冠心病吸烟受试者巨噬细胞ABCA1的mRNA表达显著低于不吸烟的正常受试者,而健康吸烟受试者巨噬细胞ABCA1的mRNA表达高于健康非吸烟受试者。巨噬细胞ABCG1蛋白表达和诱导胆固醇外流功能在三组人群中无显著差异；4.基线时,由ABCA1诱导的以apoA-1为接受体的巨噬细胞胆固醇外流功能测定结果为：健康非吸烟受试者显著高于健康吸烟者(9.97%±2.00vs.15.30%±5.70,p<0.001),健康非吸烟受试者显著高于冠心病吸烟者(8.15%±1.5vs.15.30%±5.70,p<0.001),冠心病吸烟者显著低于健康吸烟者(8.15%±1.52vs.9.97%+2.00,p=0.017)；5.CAD戒烟组受试者戒烟三个月后,巨噬细胞ABCA1蛋白和mRNA表达增加,诱导巨噬细胞内胆固醇外流功能显著改善(8.14%±1.61vs.11.47%+3.61,p=0.004)；与平行对照组相比,CAD戒烟组受试者巨噬细胞ABCA1诱导胆固醇外流率增加值有显著改善(3.33%±3.72vs.0.64%±1.97,p=0.036)。戒烟后,ABCG1的mRNA表达上调(p<0.001),但蛋白表达和功能无显著变化；6.健康戒烟组受试者戒烟三个月后,巨噬细胞ABCA1蛋白表达和功能无显著改变,ABCA1的mRNA表达显著增高(p<0.001)；巨噬细胞ABCA1介导的胆固醇外流率显著改善(10.61%±1.84vs.11.53%±2.78,p=0.002),但与平行对照组相比,外流率变化值无显著差异(1.77%±1.57vs.0.92%±1.98,p=0.255)。健康戒烟组受试者戒烟三个月后ABCG1的表达和介导胆固醇外流功能未见显著改变；7.烟草成分中,尼古丁浓度依赖的增加THP-1巨噬细胞ABCA1蛋白和mRNA的表达,增加细胞表面CD36的表达。健康不吸烟者一小时内吸入10颗香烟后,巨噬细胞ABCA1蛋白和mRNA的表达上调；一氧化碳不影响THP-1巨噬细胞ABCA1的表达。研究结论长期吸烟导致巨噬细胞ABCA1表达及诱导胆固醇外流功能下降,ABCA1功能下降可能与吸烟者血浆HDL-C水平降低有关。冠心病吸烟人群戒烟3个月,巨噬细胞ABCA1的表达和功能显著改善。ABCG1不参与吸烟相关的巨噬细胞脂代谢紊乱。烟草中主要成分尼古丁增加巨噬细胞ABCA1和CD36的表达,而一氧化碳对ABCA1无显著影响。