膀胱癌是一种在泌尿系统中常见的恶性肿瘤,其发病率近年有上升趋势；在我国,膀胱癌是泌尿系统中发病率和危害性最大的肿瘤。一般认为,膀胱癌的早期诊断和发现对于提高患者的生存率极具意义。尽管膀胱癌分子生物标志物的概念已广为接受,但是在临床实践中,分子标志物的应用仍然有限。如何发现高灵敏度和高特异性的分子标志物是肿瘤研究的重要方向。本研究试图从三个技术层次出发,探讨如何提高膀胱癌蛋白质标志物的发现与验证效率。膀胱是储备尿液的器官,因此尿液被广泛认为是发现膀胱癌生物标志物的理想材料。然而,尿液受饮食等条件影响太大而且含有许多高丰度蛋白质,这些因素限制了直接从尿液中筛选膀胱癌标志物的工作效率。本实验中,我们从收集膀胱癌相关细胞系的分泌蛋白质入手,通过蛋白质组分析鉴定癌症相关蛋白质,然后跟踪这些候选物在尿液中的丰度。这种分泌蛋白质-尿液标志物的研究策略提高了工作效率,有效降低了实验上的难度。蛋白质组技术仍处在不断改进的过程中,没有一个分析方法能够完全应对所有的蛋白质鉴定。我们认为,应当从整合技术的角度出发开展蛋白质标志物的筛选工作。因此,我们在本研究中同时采用了分离完整蛋白质的双向电泳(2DE)和分离消化后肽段的反向液相色谱(RP-LC),力图扩大标志物筛选的范围。蛋白质标志物发现的核心技术问题是如何准确定量和评价差异蛋白质。我们在本研究中采用了全谱鉴定(2DE-MS/MS和iTRAQ)和靶向定量(MRM)分析,前者能规模化定量筛选差异蛋白质,而后者则能大规模的定量验证候选标志物。我们选择在膀胱癌研究中广泛使用的两种膀胱癌细胞系5637和T24以及一种相对正常细胞系SV-HUC-1,在细胞条件培养基中收集分泌蛋白质,然后利用2DE和iTRAQ联用质谱的方法分离和鉴定分泌蛋白质,并进行相对定量分析。2DE胶图比较和质谱鉴定显示：5637和T24细胞与SV-HUC-1细胞的分泌蛋白质相比分别有72和79个差异蛋白质。值得注意的是,二者的重叠程度甚小；但是许多被鉴定的蛋白质在2DE胶图上均含有多个显色斑点,提示分泌蛋白质存在广泛的修饰现象。iTRAQ的定量分析表明：5637和T24细胞的分泌蛋白质与SV-HUC-1细胞的分泌蛋白质相比,分别有228和535个差异蛋白质。分泌蛋白质丰度在三个细胞系的分布说明,5637与SV-HUC-1的分布接近,而T24与另外两个细胞系的分布差距甚远。重要的是,文献搜索和分泌及尿液属性分析的结果展现,大部分的差异分泌蛋白质可在血液或尿液中检测到。考虑到各个蛋白质组分析技术的优缺点和互补性,我们将产生于两种完全不同技术的定量结果组合起来,最终确定在5637和T24细胞中共有724种差异的分泌蛋白质,它们构成了膀胱癌尿液蛋白质标志物的候选系列。我们采用SWATH技术全谱性地扫描尿液蛋白质,并结合考虑膀胱癌细胞系的分泌蛋白质候选物,从尿液蛋白SWATH数据中筛选得到了94种可检测蛋白质。在进一步综合肽段碎裂的理论分析和实际的二级质谱谱图的基础上,选定了17种蛋白质作为尿液蛋白靶标定量分析的对象。采用多反应监测(Multiple Reaction Monitoring, MRM)技术对23例膀胱癌患者和24例健康人的尿液样本进行了17种靶标蛋白质的定量测定。为了保证定量比较的准确性,同一样本的MRM定量信号的CV值严格控制在20%以下。结果表明,10种靶标蛋白质在膀胱癌患者和健康人尿液之间存在显著差异。若将这些靶标蛋白质置于受试者工作特征性(ROC)曲线,那么补体成分3(C03)和乳糖脱氢酶B(LDHB)的组合能够更敏感和高效地区分膀胱癌和正常尿液。