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目的本文以乳腺癌细胞株MDA-MB-231为实验材料,建立脂多糖(LPS)诱导的肿瘤炎性微环境体外模型,检测氢分子对乳腺癌炎性微环境的影响,初步探讨氢分子抑制肿瘤炎性微环境的内在分子机理;同时建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型,观察氢气对裸鼠成瘤性的影响,为氢分子的临床应用提供理论依据。方法1.体外培养MDA-MB-231人乳腺癌细胞株,制备经LPS诱导的巨噬细胞条件培养基。接种对数生长期的乳腺癌细胞于6孔板中,分别设置正常培养基空白对照组、条件培养基处理组、条件培养基+高纯度饱和氢气处理6 h组和处理12 h组。免疫印迹检测氢分子对MDA-MB-231细胞炎性炎性相关蛋白p-STAT3和COX-2表达水平的影响,观察氢分子对MAPK激酶信号通路关键因子及其下游靶蛋白CREB的影响;酶联免疫吸附试验检测氢分子对白细胞介素6(IL-6)分泌表达的影响。2.体外培养MDA-MB-231乳腺癌细胞,并接种于6孔板中,随机分为两组:即空白对照组和氢分子处理组。空白对照组加L-15完全培养基,氢分子加高纯度氢气饱和的L-15培养基。免疫印迹法检测两组中自噬相关蛋白LC3-II和Beclin-1表达水平的变化,体外小管形成实验观察氢分子对血管生成的影响,同时检测血管生成因子VEGF表达水平的变化。3.选择Bal b/c纯系裸鼠10只,皮下注射人乳腺癌MDA-MB-231细胞建立裸鼠肿瘤模型,并随机分为氧气+氢气组、氧气+氮气组两组(n=5)。自接种日起,分别吸入氢氧及氮氧混合气体,每次1h,持续30d。完整取出肿瘤,测量肿瘤大小。Western Blot检测p-STAT3、COX-2、CREB及PPAR-γ等炎性因子的表达水平;免疫组织化学检测肿瘤组织中p-STAT3和COX-2的表达。结果1.氢分子抑制乳腺癌细胞炎性相关因子的表达免疫印迹结果显示,巨噬细胞条件培养基能够上调乳腺癌细胞中p-STAT3及COX-2的蛋白表达,而氢分子能够显著抑制条件培养基对p-STAT3与COX-2的诱导作用(P<0.05)。MDA-MB-231细胞经条件培养基处理后,JNK的磷酸化水平下降,氢分子可以显著拮抗条件培养基对JNK活性的抑制作用;同时,氢分子下调MAPK下游靶蛋白CREB的表达。另外,氢分子能够抑制乳腺癌细胞中IL-6的分泌表达。2.氢分子对乳腺癌细胞自噬的抑制作用免疫印迹法检测发现,氢分子处理MDA-MB-231细胞24h后,LC3-II/LC3-I比值显著降低(P<0.05),表明氢分子能够抑制乳腺癌细胞的自噬。3.氢气对乳腺癌移植瘤的影响氢气干预组肿瘤体积、重量均无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05)。另外,免疫组织化学结果显示,氢气可抑制COX-2、p-STAT3的表达,说明氢气干预后的裸鼠乳腺癌细胞的增殖能力减弱;免疫印迹法检测发现,氢气能够抑制裸鼠乳腺癌COX-2、CREB、PPAR-γ及p-STAT3蛋白的表达。结论1.氢分子能够显著抑制MDA-MB-231细胞肿瘤微环境中炎性因子的分泌表达;同时有效抑制细胞自噬水平。2.氢分子能够抑制裸鼠移植瘤中炎性因子的表达,氢分子不能够直接抑制体内肿瘤的生长。